Name: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por financiamento da Fundação Nacional de Ciência suíça (concessão de projetos 31003A_173188; www.snf.ch) e da Universidade de Berna (www.unibe.ch) para a BS. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

1. Preparação de reagentes e estoques para ensaio click-it EdU
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1 para obter detalhes sobre o kit e os reagentes fornecidos com o kit.
<ol><li>Leve os frascos à temperatura ambiente antes de preparar as soluções.</li>
	<li>Prepare a solução de estoque EdU de 10 mM (componente A) adicionando 2 mL de dimetilsulfoxida (DMSO, componente C). Misture bem e armazene a -20 °C.</li>
	<li>Prepare uma solução de ...

<ol>
	<li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom.">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li><li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle:+a+review+of+regulation,+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer.">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li><li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation.">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li><li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells.">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894 (2015).</li><li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+regulation+by+checkpoints.">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers:+A+comparative+study+with+Ki67.">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts.">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).</li><li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue.">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li><li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miranda,+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division,+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster.">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase.">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+Drosophila+larval+brain.">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li><li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NVX-412,+a+new+oncology+drug+candidate,+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner.">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015 (2012).</li><li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53/p21(WAF1)+signalling+pathway.">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides.">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li><li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+S-phase+control.">Developing S-phase control.</a> Genes &amp; Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li><li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex.">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li><li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly-FUCCI:+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues.">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li><li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers.">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li></ol>

A incorporação da EdU e sua reação subsequente de "clique" com azida permeável celular apresenta vantagens práticas desta técnica sobre o método BrdU utilizado anteriormente7. No entanto, essa reação é catalisada por íons Cu(I), e vários corantes podem ser instáveis na presença deste catalisador de cobre, como é claramente aconselhado pelo fabricante do kit Click-it EdU. Quando os experimentos de imunosstaining foram realizados após a execução da etapa de detecção da EdU, a in...

O ciclo de divisão celular compreende uma fase G1 (primeira fase de lacuna), uma fase replicativa/S, um G2 (segunda fase de lacuna) e uma fase M (mitótica). Passando por essas fases, a célula sofre mudanças drásticas na transcrição celular, tradução e reorganização das máquinas citoesquelletais1,2. Em resposta às sugestões de desenvolvimento e meio ambiente, as células podem deixar temporariamente de dividir e tornar-se quiescentes (G0) ou diferenciar e parar permanentemente de dividir3. Outros cenários, como danos ao DNA, podem causar diferenciação prematura ou apoptose3,4. A resposta a tais pistas é mediada por pontos de verificação de ciclo celular, que atuam como um sistema de vigilância para garantir a integridade dos processos celulares essenciais antes que a célula se comprometa com a próxima fase do ciclo de divisão5. Portanto, estudos sobre genes que regulam a replicação do DNA, pontos de verificação e máquinas mitóticas precisam analisar possíveis defeitos de progressão do ciclo celular que podem ocorrer em células mutantes ou no knockdown do siRNA desses genes. Além disso, tais análises podem ser empregadas para testar a saúde geral das células, bem como as respostas celulares ao tratamento medicamentoso.
5-bromo-2'-desoxyuridina (BrdU) é um analógico de timmidina que é incorporado ao DNA durante a replicação6. Este método foi utilizado extensivamente para identificar células em fase S. No entanto, as células são então submetidas a procedimentos severos de desnaturação de DNA para permitir a detecção de BrdU através do uso de anticorpos anti-BrdU6. Este tratamento severo pode danificar epítopos celulares e evitar uma caracterização adicional da amostra através da imunostainagem. A incorporação da EdU e a posterior detecção por uma "reação de clique" catalisada por cobre com corantes de azide pequenos, permeáveis e fluorescentes elimina a necessidade de procedimentos de desnaturação severos7. Esse método, portanto, emergiu como uma alternativa mais prática à incorporação da BrdU.
Além disso, o pH3 tem sido descrito como um marcador confiável para células de fase mitótica/M8. Histone H3 é uma proteína histona de núcleo associada ao DNA que se torna fosfoilada em torno da fase G2 tardia até a fase M inicial e é desfosforilada no final da anáfase8. Vários anticorpos comerciais podem ser usados para detectar pH3 usando protocolos padrão de imunossuagem. A coloração dupla de EdU e pH3 permitiria, portanto, a detecção de células em fase S, bem como em fase M. Além disso, as células do G1 e início da fase G2 não manchariam positivamente nenhum dos marcadores.
As células-tronco neurais drosophila ou neuroblastos (NBs) oferecem um modelo de células-tronco bem caracterizados onde as células se dividem assimetricamente para produzir um NB auto-renovador idêntico e uma célula-mãe de gânglio (GMC), que é fadada à diferenciação9. Além disso, várias ferramentas genéticas e anticorpos específicos do RN tornam este sistema adequado para manipulação genética e imagens de células vivas. Consequentemente, vários estudos utilizaram NBs para estudar genes que regulam divisões assimétricas e determinação do destino celular9. Populações distintas de NBs existem no cérebro central (CB) e no lobo óptico (OL) do cérebro larval9; Foram utilizados NBs cb para o presente estudo. Estas terceiras NBs cb larval instar são células grandes que também são adequadas para estudar fatores que regulam a montagem de fuso mitótico. Um protocolo para analisar defeitos de progressão do ciclo celular seria uma ferramenta vital em tais estudos.
Protocolos publicados anteriormente empregavam kits comerciais, como o Kit de Proliferação celular Click-iT EdU Alexa Fluor, que fornecem vários componentes de reação e corantes de azida marcados com uma variedade de corantes Alexa Fluor para incorporação e detecçãoedu 10. No entanto, os reagentes fornecidos com tais kits não são compatíveis com algumas etiquetas fluorescentes frequentemente usadas com anticorpos secundários. Este kit de detecção de células EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fornecido com corante de azide alexa fluor 647) foi testado em Drosophila terceiro NBs larval instar, e co-coloração foi tentado com anticorpos contra pH3 e Miranda, um marcador para NBs. Além disso, foram utilizados anticorpos secundários alexa Fluor 568 ou Cy3 para detecção da rotulagem de Miranda na membrana plasmática de NBs11. No entanto, a intensidade esperada do sinal e o padrão de coloração (resultados inéditos) não foram observados com esses anticorpos secundários quando a imunossagem foi realizada após a detecção da EdU.
Para a incorporação da EdU, o protocolo descrito por Daul e colegas exigia alimentação das larvas com meio Kankel-Branco misturado com EdU e azul bromofenol (BPB)10. As larvas se alimentavam do alimento EdU e bpb-spiked, que podiam ser vistos por sua cor azul após a ingestão no intestino larval. Embora este método tenha sido utilizado para a incorporação da EdU em Mms19 loss-of-function(Mms19P) terceira larva instar, as larvas Mms19P aparentemente não se alimentaram, pois quase nenhuma cor azul foi detectada no intestino larval (resultados inéditos). As larvas mms19P mostram drásticas deformidades de desenvolvimento e eventualmente prendem na terceira fase instar. Isso pode de alguma forma afetar o comportamento alimentar da terceira larva instar e tornar o protocolo de alimentação da EdU inadequado para esses casos.
Após estudar a literatura disponível e trabalhar extensivamente na padronização de etapas essenciais, foi proposta uma abordagem alternativa para a rotulagem dupla EdU/pH3 em NBs Drosophila, o que não requer alimentação de EdU para larvas. Um estudo anterior utilizou coloração dupla de EdU/pH3 para analisar o ciclo celular em NBs, mas não apresentou um protocolo detalhado4. Isso representa um obstáculo desnecessário para os laboratórios que tentam implementar esse método. Além disso, avaliar a compatibilidade de vários reagentes com o kit EdU e realizar uma maior otimização pode ser um processo demorado. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo que abrange a incorporação da EdU em cérebros larvais dissecados e imunostaining com anticorpos anti-pH3, seguido de microscopia confocal e análise de imagem para alocar NBs para quatro categorias distintas: fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e fase M. As etapas que precisam de otimização são delineadas e dicas fornecidas para análise de imagens de grandes conjuntos de dados. Além disso, a leitura de EdU/pH3 em NBs do tipo selvagem é analisada e comparada com os NBs Mms19P, que foram recentemente relatados para mostrar um atraso no ciclocelular 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#15477</td>
			<td>P-element insertion in the third exon of Mms19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td>
			<td>Generated in house</td>
			<td></td>
			<td>eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#3605</td>
			<td>wild-type stock (w;+;+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Miranda</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab197788</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pH3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9701</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>112-165-167</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27034</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Imagej)</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graph pad software</td>
			<td>Version 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water-soluble, non-fluorescing mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

A análise de progressão do ciclo in vivo é realizada rotineiramente em estudos sobre genes que regulam mitose e replicação de DNA. 5-Ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) foi utilizado para investigar a progressão replicativa/fase S, enquanto anticorpos contra fosfo-histona H3 foram utilizados para marcar núcleos e células mitóticas. Uma combinação de ambos os rótulos permitiria a classificação das fases G0/G1 (Fase gap), S (replicativa) e M (mitostítico) e serviria como uma ferramenta importante para avaliar os efeitos de knockdowns de genes mitotísticos ou mutantes nulos na progressão do ciclo celular. No entanto, os reagentes usados para marcar células rotuladas pela EdU são incompatíveis com várias etiquetas secundárias de anticorpos fluorescentes. Isso complica a imunostaining, onde anticorpos secundários primários e marcados são usados para marcar células mitóticas pH3 positivas. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para a rotulagem dupla de EdU e pH3 em células-tronco neurais larval Drosophila, um sistema utilizado extensivamente para estudar fatores mitóticos. Além disso, é fornecido um protocolo para análise de imagem e quantificação para alocar células rotuladas em 3 categorias distintas, G0/G1, S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e M.

O terceiro cérebro larval de Drosophila bi-lobed tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar processos celulares e de desenvolvimento fundamentais9. O foco do presente estudo foi apresentar um protocolo para análise da progressão do ciclo celular em NBs EdU e pH3 da região do CB (Figura 1). Os NBs CB são subdivididos em tipo I e tipo II, e exibem o padrão característico de divisão assimétrica9. Cada divisão tipo I ...

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5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE 

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

Neste protocolo, não apenas fornecemos uma explicação detalhada de cada etapa da incorporação e imunostaining da EDU, mas também explicamos a aquisição de imagens, o processamento de imagens e fornecemos algumas dicas para analisar grandes conjuntos de dados. Essa técnica permite a alocação de células nas fases G1, S e M. Isso será particularmente útil para a análise do ciclo celular em estudos sobre não mutações que afetam genes mitóticos.Esperamos que as pessoas lutem por dois a três meses se não tiverem conhecimento prévio ou experiência com essa técnica. Para começar, adicione o meio de dissecção de Schneider ou SM a duas depressões consecutivas de uma placa de brilho e adicione PBS à depressão subsequente. Usando um par de fórceps, pegue a terceira larva instar errante e coloque-as em um tecido decotado com PBS para limpar resíduos de alimentos de mosca.Coloque a larva na depressão com PBS seguida da depressão consecutiva contendo SM. Em seguida, sob um microscópio de dissecção, use fórceps finos para remover três quartos da parte inferior do corpo da larva. Em seguida, pegue suavemente os ganchos de boca larval com um par de fórceps e segure a cutícula da outra extremidade com o outro par de fórceps. Gire a cabeça larval do avesso empurrando os ganchos da boca para dentro e, simultaneamente, descascando o tecido na outra extremidade.Observe o cérebro larval com discos imagináveis ligados. Remova outros tecidos ligados ao cérebro e transfira o cérebro para a depressão consecutiva subsequente com SM. Adicione 100 microliters de 100 micromolar EDU SM solução para outra depressão na placa Pyrex e incubar aproximadamente 5 a 10 cérebros dissecados nesta solução por 2 horas a 25 graus Celsius. Após fixação e imunostaining remova o PBST e adicione o coquetel de detecção de EDU aos cérebros dissecados.Em seguida, incuba-los à temperatura ambiente no escuro em um neutater. Após 30 minutos, lave as amostras duas vezes com PBST por 10 minutos por lavagem no escuro. Para coloração de DNA, prepare 5 microgramas por solução mililitro Hoechst 33342.Remova o PBST após a segunda lavagem e adicione 500 microliters da solução Hoechst aos cérebros dissecados e, em seguida, incuba-os no escuro. Após 10 minutos, retire o Hoechst e lave as amostras com PBST por 10 minutos. Bata o tubo no banco do laboratório e deixe os miolos se acalmarem.Remova o PBST do tubo, deixando para trás 50 a 100 microlitres. Corte a ponta de um micropipet de 200 microliter e use-o para transferir o cérebro para um escorregador de vidro limpo. Remova o pbst de acesso do slide manchando-o com tiras de papel de filtro.Não deixe o papel filtro tocar no cérebro. Coloque uma gota de um meio de montagem solúvel em água, não fluorescing no cérebro e oriente os cérebros de tal forma que o fio nervoso ventral enfrente o slide e os lóbulos voltados para cima. Organize o cérebro em um único arquivo para que seja mais fácil imaginar o cérebro em série.Coloque suavemente um deslizamento de cobertura em cima do cérebro e incubar o slide durante a noite a 2 a 6 graus Celsius. A partir do software de aquisição selecione o objetivo 63 vezes. Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa deslize logo acima do cérebro montado para facilitar a localização do tecido através da ocular.Usando o canal Dappy Hoechst 33342, encontre o cérebro através da ocular e, em seguida, mude para o modo de aquisição no software. Configure 4 canais para imagem Hoechst 33342, Alexa piso 4 8 8, alexa piso 5 6, 8 e alexa piso 64 7. Use a ferramenta assistente de corante para configurar automaticamente os lasers de excitação de corantes selecionados e filtros de emissão.Defina o campo de visão, de tal forma que engloba todo o lobo cerebral. Imagem de todo o volume do lobo cerebral adquirindo este imposto espaçado 0,8 míclicas separados. Armazene todas as imagens de uma sessão de imagem em um formato de biblioteca ponto L I F.Para análise de imagem, abra Fiji, arraste e solte os arquivos LIF em Fiji. Selecione o navegador de dados na guia de visualização de pilhas e use pilha virtual na guia de gerenciamento de memória no plugin de formatos biológicos. Observe a imagem multicanal exibida na imagem J.Altere a cor dos canais da barra de menu, usando a ferramenta imagem, cor e canais.E monitorar os neuroblastos rotulados por Miranda, que aparecem como grandes células redondas na região central do cérebro. Desenhe uma região de interesse usando a ferramenta de elipse sobre cada neuroblasto para evitar contar o neuroblasto duas vezes. Na barra de menu de imagem J, selecione análise, ferramentas e gerenciador de ROI.Marque todos os neuroblastos na seção Z atual e pressione T após marcar cada célula. Uma vez marcados todos os neuroblastos da atual seção Z, mude os canais para pH3 e EDU e conte manualmente o número de neuroblastos positivos de EDU, neuroblastos positivos pH3, neuroblastos positivos EDU e pH3, e neuroblastos não manchando para nenhum dos marcadores. Procure por neuroblastos e seções Z subsequentes, exclua ROIs antigos e adicione novos ROIs para contar neuroblastos em pilhas diferentes.Prepare uma planilha e calcule os percentuais de neuroblastos presentes nas quatro categorias para cada lobo. Prepare um gráfico de barras usando o software de planilhas, mostrando os dados de pools para porcentagens de neuroblastos em cada categoria. Neuroblastos cerebrais centrais do terceiro cérebro larval instar marcados com Miranda, EDU e pH3 são mostrados aqui.As células foram alocadas nas fases G1/G0, S, SG2/M e M. Na análise do pH3 EDU, uma proporção significativamente maior de MMS19, a perda de neuroblastos de função foi encontrada na fase M em comparação com neuroblastos do tipo selvagem. A expressão MMS19:eGFP na perda de fundo de função MMS19 resgatou a proporção de células em fase M para níveis de tipo selvagem.É importante não usar cérebros danificados para etapas subsequentes. E a solução ED deve ser preparada recentemente antes de iniciar as dissecções. Este ativo pode ser usado como uma triagem inicial rápida para identificar defeitos em fases específicas de ciclo celular.Isso poderia então ser seguido por uma análise mais detalhada de uma determinada fase.

Research

JoVE Journal

Biology

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Counting Human Neural Stem Cells

Contando células-tronco neurais

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Biologia

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE 

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells (Video) | JoVE 

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors (Video) | JoVE 

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) Using Retroviral Vector with GFP (Video) | JoVE 

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE 

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus (Video) | JoVE 

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR (Video) | JoVE 

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...