Name: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (subvención del proyecto 31003A_173188; www.snf.ch) y la Universidad de Berna (www.unibe.ch) a BS. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

1. Preparación de reactivos y existencias para el ensayo Click-it EdU
NOTA: Consulte la Tabla de materiales y la Tabla 1 para obtener detalles sobre el kit y los reactivos suministrados con el kit.
<ol><li>Lleve los viales a temperatura ambiente antes de preparar las soluciones.</li>
	<li>Preparar una solución madre de EdU (componente A) de 10 mM añadiendo 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO, componente C). Mezclar bien y conservar a -20 °C.</li>
	<li>Prepar...

<ol>
	<li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom.">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li><li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle:+a+review+of+regulation,+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer.">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li><li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation.">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li><li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells.">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894 (2015).</li><li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+regulation+by+checkpoints.">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers:+A+comparative+study+with+Ki67.">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts.">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).</li><li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue.">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li><li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miranda,+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division,+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster.">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase.">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+Drosophila+larval+brain.">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li><li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NVX-412,+a+new+oncology+drug+candidate,+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner.">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015 (2012).</li><li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53/p21(WAF1)+signalling+pathway.">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides.">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li><li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+S-phase+control.">Developing S-phase control.</a> Genes &amp; Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li><li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex.">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li><li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly-FUCCI:+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues.">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li><li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers.">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li></ol>

La incorporación de EdU y su posterior reacción de 'clic' con azida permeable a células presenta ventajas prácticas de esta técnica sobre el método BrdU utilizado anteriormente7. Sin embargo, esta reacción es catalizada por iones Cu(I), y varios colorantes pueden ser inestables en presencia de este catalizador de cobre, como lo aconseja claramente el fabricante del kit Click-it EdU. Cuando se realizaron experimentos de inmunotinción después de ejecutar el paso de detección de EdU, no se ...

El ciclo de división celular comprende una fase G1 (primera fase de brecha), una fase replicativa/S, una G2 (segunda fase de brecha) y una fase M (mitótica). Al pasar por estas fases, la célula sufre cambios dramáticos en la transcripción celular, la traducción y la reorganización de la maquinaria citoesquelética1,2. En respuesta a las señales ambientales y de desarrollo, las células pueden dejar de dividirse temporalmente y volverse inactivas (G0) o diferenciarse y dejar de dividirse permanentemente3. Otros escenarios, como el daño al ADN, pueden causar diferenciación prematura o apoptosis3,4. La respuesta a tales señales está mediada por puntos de control del ciclo celular, que actúan como un sistema de vigilancia para garantizar la integridad de los procesos celulares esenciales antes de que la célula se comprometa con la siguiente fase del ciclo de división5. Por lo tanto, los estudios sobre genes que regulan la replicación del ADN, los puntos de control y la maquinaria mitótica deben analizar los posibles defectos de progresión del ciclo celular que pueden ocurrir en las células mutantes o en el derribo de siRNA de estos genes. Además, tales análisis pueden emplearse para probar la salud celular general, así como las respuestas celulares al tratamiento farmacológico.
La 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) es un análogo de la timidina que se incorpora al ADN durante la replicación6. Este método se utilizó ampliamente para identificar células en fase S. Sin embargo, las células se someten a duros procedimientos de desnaturalización del ADN para permitir la detección de BrdU mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU6. Este tratamiento severo puede dañar los epítopos celulares e impedir una mayor caracterización de la muestra a través de la inmunotinción. La incorporación de EdU y la posterior detección mediante una "reacción de clic" catalizada por cobre con colorantes de azida pequeños, permeables a las células y marcados fluorescentemente elimina la necesidad de procedimientos de desnaturalización severos7. Este método, por lo tanto, surgió como una alternativa más práctica a la incorporación de BrdU.
Además, pH3 se ha descrito como un marcador fiable para las células de fase mitóticas/M8. La histona H3 es una proteína histona central asociada al ADN que se fosforila alrededor de la fase G2 tardía a la fase M temprana y se desfosforila hacia el final de la anafase8. Se pueden utilizar varios anticuerpos comerciales para detectar pH3 utilizando protocolos estándar de inmunotinción. Por lo tanto, la tinción dual de EdU y pH3 permitiría la detección de células en fase S y fase M. Además, las células en la fase G1 y G2 temprana no se tiñen positivamente para ninguno de los marcadores.
Las células madre neurales o neuroblastos (NB) de Drosophila ofrecen un modelo de células madre bien caracterizado en el que las células se dividen asimétricamente para producir una NB autorrenovadora idéntica y una célula madre ganglionar (GMC), que está destinada a la diferenciación9. Además, varias herramientas genéticas y anticuerpos específicos de NB hacen que este sistema sea adecuado para la manipulación genética y las imágenes de células vivas. En consecuencia, varios estudios han utilizado NB para estudiar genes que regulan las divisiones asimétricas y la determinación del destino celular9. Existen distintas poblaciones de NB en el cerebro central (CB) y el lóbulo óptico (OL) del cerebro larvario9; Se utilizaron NB CB para el estudio actual. Estas terceras larvas de CB NB son células grandes que también son adecuadas para estudiar los factores que regulan el ensamblaje del huso mitótico. Un protocolo para analizar los defectos de progresión del ciclo celular sería una herramienta vital en tales estudios.
Los protocolos publicados anteriormente empleaban kits comerciales, como Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, que proporcionan varios componentes de reacción y colorantes de azida etiquetados con una variedad de tintes Alexa Fluor para la incorporación y detección de EdU10. Sin embargo, los reactivos suministrados con tales kits no son compatibles con algunas etiquetas fluorescentes que a menudo se usan con anticuerpos secundarios. Este kit de detección EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit suministrado con el colorante de azida conjugada Alexa Fluor 647) se probó en NB larvales de Drosophila tercer instar, y se intentó la tinción conjunta con anticuerpos contra pH3 y Miranda, un marcador para NB. Además, se utilizaron anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor 568 o Cy3 para la detección del etiquetado de Miranda en la membrana plasmática denbs 11. Sin embargo, la intensidad esperada de la señal y el patrón de tinción (resultados no publicados) no se observaron con estos anticuerpos secundarios cuando se realizó la inmunotinción después de la detección de EdU.
Para la incorporación de EdU, el protocolo descrito por Daul y sus colegas requirió la alimentación de las larvas con medio Kankel-White mezclado con EdU y azul de bromofenol (BPB)10. Las larvas se alimentaron de los alimentos con picos de EdU y BPB, que se podían ver por su color azul al ingerirlos en el intestino larvario. Aunque este método se utilizó para la incorporación de EdU en mms19 pérdida de función(Mms19P)tercera larva instar, las larvas mms19P aparentemente no se alimentaron ya que apenas se detectó color azul en el intestino larvario (resultados no publicados). Las larvas de Mms19P muestran deformidades drásticas del desarrollo y eventualmente se detienen en la tercera etapa de instar. Esto puede afectar de alguna manera el comportamiento de alimentación de las larvas de la tercera instar y hacer que el protocolo de alimentación EdU no sea adecuado para tales casos.
Después de estudiar la literatura disponible y trabajar extensamente en la estandarización de pasos esenciales, se propuso un enfoque alternativo para el doble etiquetado EdU / pH3 en Drosophila NBs, que no requiere alimentar EdU a las larvas. Un estudio previo empleó tinción dual EdU/pH3 para analizar el ciclo celular en NB, pero no presentó un protocolo detallado4. Esto presenta un obstáculo innecesario para los laboratorios que intentan implementar este método. Además, evaluar la compatibilidad de varios reactivos con el kit EdU y realizar una mayor optimización puede ser un proceso que consume mucho tiempo. Este artículo presenta un protocolo paso a paso que cubre la incorporación de EdU en cerebros larvales disecados e inmunotinción con anticuerpos anti-pH3, seguido de microscopía confocal y análisis de imágenes para asignar NB a cuatro categorías distintas: fase G0 / G1, fase S, S>G2 / M (progresión de S a G2 / M) y fase M. Se describen los pasos que necesitan optimización y se proporcionan consejos para el análisis de imágenes de grandes conjuntos de datos. Además, se analiza la lectura de EdU/pH3 en NB de tipo salvaje y se compara con los NB mms19P, que recientemente se informó que mostraban un retraso en el ciclo celular11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#15477</td>
			<td>P-element insertion in the third exon of Mms19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td>
			<td>Generated in house</td>
			<td></td>
			<td>eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#3605</td>
			<td>wild-type stock (w;+;+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Miranda</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab197788</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pH3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9701</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>112-165-167</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27034</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Imagej)</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graph pad software</td>
			<td>Version 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water-soluble, non-fluorescing mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

El análisis de progresión del ciclo celular in vivo se realiza rutinariamente en estudios sobre genes que regulan la mitosis y la replicación del ADN. La 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) se ha utilizado para investigar la progresión replicativa/fase S, mientras que los anticuerpos contra la fosfo-histona H3 se han utilizado para marcar núcleos y células mitóticas. Una combinación de ambas etiquetas permitiría la clasificación de las fases G0/G1 (fase Gap), S (replicativa) y M (mitótica) y serviría como una herramienta importante para evaluar los efectos de los derribos de genes mitóticos o mutantes nulos en la progresión del ciclo celular. Sin embargo, los reactivos utilizados para marcar las células marcadas con EdU son incompatibles con varias etiquetas fluorescentes de anticuerpos secundarios. Esto complica la inmunotinción, donde se utilizan anticuerpos primarios y secundarios marcados para marcar las células mitóticas con pH3 positivo. Este artículo describe un protocolo paso a paso para el etiquetado dual de EdU y pH3 en células madre neurales larvales de Drosophila, un sistema utilizado ampliamente para estudiar los factores mitóticos. Además, se proporciona un protocolo para el análisis y cuantificación de imágenes para asignar células etiquetadas en 3 categorías distintas, G0 / G1, S, S>G2 / M (progresión de S a G2 / M) y M fases.

El cerebro larvario bilobulado de Drosophila tercer instar se ha utilizado como sistema modelo para estudiar los procesos celulares y de desarrollo fundamentales9. El objetivo del presente estudio fue presentar un protocolo para el análisis de la progresión del ciclo celular en NB marcados con EdU y pH3 de la región CB(Figura 1). Los CB NB se subdividen en tipo I y tipo II, y muestran el patrón de división asimétrica característico9</...

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5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE 

El análisis del ciclo celular con etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) y fosfo-histona H3 (pH3) es un procedimiento de varios pasos que puede requerir una optimización extensa. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe todos los pasos para este procedimiento, incluido el análisis de imágenes y la cuantificación para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular.

Protocolo de doble marcado de 5-etinil-2'-desoxiuridina/fosfo-histona H3 para el análisis de progresión del ciclo celular en células madre neurales de Drosophila

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

En este protocolo, no solo proporcionamos una explicación detallada de cada paso de la incorporación de EDU y la inmunotinción, sino que también explicamos la adquisición de imágenes, el procesamiento de imágenes y proporcionamos algunos consejos para analizar grandes conjuntos de datos. Esta técnica permite la asignación de células en fases G1, S y M. Esto será particularmente útil para el análisis del ciclo celular en estudios sobre no mutaciones que afectan a genes mitóticos.Esperaríamos que las personas luchen durante dos o tres meses si no tienen conocimientos previos o experiencia con esta técnica. Para comenzar, agregue el medio de disección de Schneider o SM a dos depresiones consecutivas de una placa de punto brillante y agregue PBS a la depresión posterior. Usando un par de fórceps, recoja las larvas errantes del tercer instar y colóquelas en un tejido con PBS para limpiar los residuos de alimentos para moscas.Coloque la larva en la depresión con PBS seguido de la depresión consecutiva que contiene SM. A continuación, bajo un microscopio de disección, use fórceps finos para eliminar tres cuartas partes de la parte inferior del cuerpo de la larva. Luego agarre suavemente los ganchos bucales larvales con un par de fórceps y sostenga la cutícula del otro extremo con el otro par de fórceps. Gire la cabeza de la larva al revés empujando los ganchos de la boca hacia adentro y simultáneamente despegando el tejido en el otro extremo.Observe el cerebro larvario con discos imaginales adjuntos. Elimine otros tejidos unidos al cerebro y transfiera el cerebro a la posterior depresión consecutiva con SM. Agregue 100 microlitros de solución micromolar EDU SM de 100 a otra depresión en la placa Pyrex e incube aproximadamente de 5 a 10 cerebros disecados en esta solución durante 2 horas a 25 grados Centígrados. Después de la fijación y la inmunotinción, elimine el PBST y agregue el cóctel de detección de EDU a los cerebros disecados.Luego incube a temperatura ambiente en la oscuridad en un castrativo. Después de 30 minutos, lave las muestras dos veces con PBST durante 10 minutos por lavado en la oscuridad. Para la tinción de ADN, prepare 5 microgramos por mililitro de solución Hoechst 33342.Retire el PBST después del segundo lavado y agregue 500 microlitros de la solución de Hoechst a los cerebros disecados, luego incube en la oscuridad. Después de 10 minutos, retire el Hoechst y lave las muestras con PBST durante 10 minutos. Golpee el tubo en el banco del laboratorio y deje que los cerebros se asienten.Retire el PBST del tubo, dejando atrás de 50 a 100 microlitros. Corte el extremo de una punta de micropipeta de 200 microlitros y úsela para transferir los cerebros a un portaobjetos de vidrio limpio. Elimine el PBST de acceso de la diapositiva borrándola con tiras de papel de filtro.No deje que el papel de filtro toque los cerebros. Coloque una gota de un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente en los cerebros y oriente los cerebros de tal manera que el cordón nervioso ventral se enfrente al tobogán y los lóbulos hacia arriba. Organice los cerebros en un solo archivo para que sea más fácil obtener imágenes de los cerebros en serie.Coloque suavemente un resbalón de cubierta en la parte superior del cerebro e incube el tobogán durante la noche a 2 a 6 grados centígrados. Desde el software de adquisición seleccione el objetivo de 63 veces. Coloque una gota de aceite de inmersión en el resbalón de la cubierta justo encima de los cerebros montados para facilitar la localización del tejido a través del ocular.Usando el canal dappy Hoechst 33342, encuentre el cerebro a través del ocular y luego cambie al modo de adquisición en el software. Configure 4 canales para obtener imágenes de Hoechst 33342, Alexa floor 4 8 8, Alexa floor 5 6, 8 y Alexa floor 6 4 7. Utilice la herramienta asistente de tinte para configurar automáticamente los láseres de excitación de tintes y los filtros de emisión seleccionados.Establezca el campo de visión, de modo que abarque todo el lóbulo del cerebro. Imagine todo el volumen del lóbulo cerebral adquiriendo este impuesto espaciado 0,8 micras de distancia. Almacene todas las imágenes de una sesión de imágenes en un formato de biblioteca de puntos L I F.Para el análisis de imágenes, abra Fiji, luego arrastre y suelte los archivos LIF en Fiji. Seleccione el navegador de datos en la pestaña de visualización de la pila y use la pila virtual desde la pestaña de administración de memoria en el complemento de formatos biológicos. Observe la imagen multicanal que se muestra en la imagen J.Cambie el color de los canales desde la barra de menús, utilizando la herramienta imagen, color y canales.Y monitoree los neuroblastos marcados con Miranda, que aparecen como células redondas grandes en la región central del cerebro. Dibuje una región de interés usando la herramienta de elipse sobre cada neuroblasto para evitar contar el neuroblasto dos veces. En la barra de menús de la imagen J, seleccione analizar, herramientas y administrador de ROI.Marque todos los neuroblastos en la sección Z actual y presione T después de marcar cada célula. Una vez que todos los neuroblastos en la sección Z actual estén marcados, cambie los canales a pH3 y EDU y cuente manualmente el número de neuroblastos EDU positivos, neuroblastos positivos de pH3, neuroblastos positivos de EDU y pH3, y neuroblastos que no se tiñen para ninguno de los marcadores. Busque neuroblastos y secciones Z posteriores, elimine ROI antiguos y agregue nuevos ROI para contar neuroblastos en diferentes pilas.Prepare una hoja de cálculo y calcule los porcentajes de neuroblastos presentes en las cuatro categorías para cada lóbulo. Prepare un gráfico de barras utilizando el software de hojas de cálculo, mostrando los datos de las agrupaciones para los porcentajes de neuroblastos en cada categoría. Aquí se muestran los neuroblastos cerebrales centrales de los cerebros larvales del tercer instar marcados con Miranda, EDU y pH3.Las células se asignaron a las fases G1/G0, S, SG2/M y M. En el análisis edu de pH3, se encontró una proporción significativamente mayor de MMS19, pérdida de neuroblastos funcionales en la fase M en comparación con los neuroblastos de tipo salvaje. La expresión MMS19:eGFP en el fondo de pérdida de función MMS19 rescató la proporción de células en fase M a niveles de tipo salvaje.Es importante no usar cerebros dañados para los pasos posteriores. Y la solución para la disfunción eréctil debe prepararse recién antes de comenzar las disecciones. Este activo se puede utilizar como un cribado inicial rápido para identificar defectos en fases específicas del ciclo celular.Esto podría ser seguido por un análisis más detallado de una fase en particular.

Research

JoVE Journal

Biology

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Counting Human Neural Stem Cells

Conteo de células madre neurales humanas

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Investigación

Biología

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Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

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Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

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Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

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Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) Using Retroviral Vector with GFP (Video) | JoVE 

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Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

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Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

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