Name: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av finansiering från Swiss National Science Foundation (projektbidrag 31003A_173188; www.snf.ch) och Universitetet i Bern (www.unibe.ch) till BS. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.

1. Beredning av reagenser och lager för Click-it EdU-analys
OBS: Se tabellen över material och tabell 1 för mer information om satsen och reagenserna som medföljer satsen.
<ol><li>Ta flaskorna till rumstemperatur innan du förbereder lösningarna.</li>
	<li>Förbered 10 mM EdU (komponent A) lagerlösning genom att tillsätta 2 ml dimetyllsulfoxid (DMSO, komponent C). Blanda väl och förvara vid -20 °C.</li>
	<li>Förbered en arbetslösning av Alexa Flu...

<ol>
	<li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom.">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li><li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle:+a+review+of+regulation,+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer.">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li><li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation.">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li><li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells.">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894 (2015).</li><li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+regulation+by+checkpoints.">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers:+A+comparative+study+with+Ki67.">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts.">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).</li><li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).</li><li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue.">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li><li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miranda,+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division,+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster.">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase.">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+Drosophila+larval+brain.">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li><li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NVX-412,+a+new+oncology+drug+candidate,+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner.">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015 (2012).</li><li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53/p21(WAF1)+signalling+pathway.">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides.">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li><li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+S-phase+control.">Developing S-phase control.</a> Genes &amp; Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li><li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex.">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li><li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly-FUCCI:+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues.">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li><li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers.">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li></ol>

EdU-inkorporering och dess efterföljande "klickreaktion" med cellgenomsläpplig azid ger praktiska fördelar med denna teknik jämfört med BrdU-metoden som användes tidigare7. Denna reaktion katalyseras dock av Cu(I) joner, och flera färgämnen kan vara instabila i närvaro av denna kopparkatalysator, vilket tydligt rekommenderas av Click-it EdU-kittillverkaren. När immunostaining experiment hade utförts efter att ha utfört EdU detektionssteget observerades inte den förväntade signalinten...

Celldelningscykeln består av en G1-fas (första gapfasen), en replikativ/S-fas, en G2-fas (andra gapfasen) och en M-fas (mitotisk). Genom dessa faser genomgår cellen dramatiska förändringar i cellulär transkription, översättning och omorganisation av cytoskeletala maskiner1,2. Som svar på utvecklings- och miljösignaler kan celler tillfälligt upphöra att dela sig och bli quiescent (G0) eller differentiera och permanent upphöra att dela3. Andra scenarier, såsom DNA-skador, kan orsaka för tidig differentiering eller apoptos3,4. Svar på sådana signaler förmedlas av cellcykelkontrollpunkter, som fungerar som ett övervakningssystem för att säkerställa integriteten hos väsentliga cellulära processer innan cellen förbinder sig till nästa fas av delningscykeln5. Därför måste studier på gener som reglerar DNA-replikation, kontrollpunkter och mitotiska maskiner analysera möjliga cellcykelprogressionsdefekter som kan uppstå i mutanta celler eller vid siRNA-knockdown av dessa gener. Dessutom kan sådana analyser användas för att testa övergripande cellhälsa samt cellulära svar på läkemedelsbehandling.
5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) är en tymidinanalog som införlivas i DNA under replikering6. Denna metod användes i stor utsträckning för att identifiera celler i S-fas. Cellerna utsätts dock sedan för hårda DNA-denatureringsförfaranden för att möjliggöra detektion av BrdU genom användning av anti-BrdU-antikroppar6. Denna hårda behandling kan skada cellulära epitoper och förhindra ytterligare karakterisering av provet genom immunstaining. EdU-inkorporering och efterföljande detektion av en kopparkatalyserad klickreaktion med små, cellgenomsläppliga, fluorescerande märkta azidfärger eliminerar behovet av hårda denatureringsförfaranden7. Denna metod framstod därför som ett mer praktiskt alternativ till BrdU-införlivandet.
Dessutom har pH3 beskrivits som en tillförlitlig markör för mitotiska/M-fasceller8. Histon H3 är ett DNA-associerat core histonprotein som blir fosforylerat i runt den sena G2-fasen till tidig M-fasen och avfosforyleras mot slutet av anafas8. Flera kommersiella antikroppar kan användas för att detektera pH3 med hjälp av vanliga immunstainingprotokoll. Dubbelfärgning av EdU och pH3 skulle därför göra det möjligt att upptäcka celler i S-fas samt M-fas. Dessutom skulle celler i G1 och tidig G2-fasen inte färga positivt för någon av markörerna.
Drosophila neurala stamceller eller neuroblaster (NBs) erbjuder en väl karakteriserad stamcellsmodell där celler delar sig asymmetriskt för att producera en identisk självförnyande NB och en ganglion modercell (GMC), som är fett för differentiering9. Dessutom gör flera genetiska verktyg och NB-specifika antikroppar detta system lämpligt för genetisk manipulation och levande cellavbildning. Följaktligen har flera studier använt NBs för att studera gener som reglerar asymmetriska uppdelningar och cell ödesbestämning9. Distinkta populationer av NBs finns i den centrala hjärnan (CB) och den optiska loben (OL) i larvhjärnan9; CB NBs användes för den aktuella studien. Dessa tredje instar larval CB NBs är stora celler som också är lämpliga för att studera faktorer som reglerar mitotisk spindel montering. Ett protokoll för att analysera cellcykelprogressionsdefekter skulle vara ett viktigt verktyg i sådana studier.
Protokoll publicerade tidigare använda kommersiella kit, såsom Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som ger flera reaktionskomponenter och azidfärger taggade med en mängd olika Alexa Fluor-färgämnen för EdU-inkorporering och detektion10. De reagenser som levereras med sådana satser är dock inte kompatibla med vissa fluorescerande taggar som ofta används med sekundära antikroppar. Detta EdU-detekteringskit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit som levereras med Alexa Fluor 647-konjugerat azidfärg) testades i Drosophila tredje instar larval NBs, och co-staining försöktes med antikroppar mot pH3 och Miranda, en markör för NBs. Vidare användes Alexa Fluor 568- eller Cy3-märkta sekundära antikroppar för detektion av Miranda-märkning på plasmamembranet i NBs11. Den förväntade signalintensiteten och färgning mönstret (opublicerade resultat) observerades dock inte med dessa sekundära antikroppar när immunostaining utfördes efter EdU påvisande.
För EdU-inkorporering krävde det protokoll som beskrivs av Daul och kollegor utfodring av larverna med Kankel-White medium blandat med EdU och bromofenolblå (BPB)10. Larverna matas på EdU och BPB-spetsad mat, som kunde ses av sin blå färg vid intag i larvens tarm. Även om denna metod användes för EdU-inkorporering i Mms19 förlust av funktion (Mms19P) tredje instar larver, mms19P larverna uppenbarligen inte matar eftersom knappast någon blå färg upptäcktes i larv gut (opublicerade resultat). Mms19P larverna visar drastiska utvecklingsdeformiteter och så småningom arrestera i det tredje instar-stadiet. Detta kan på något sätt påverka utfodringsbeteendet hos de tredje instar larverna och göra EdU-utfodringsprotokollet olämpligt för sådana fall.
Efter att ha studerat tillgänglig litteratur och arbetat mycket med standardisering av väsentliga steg, föreslogs ett alternativt tillvägagångssätt för EdU/pH3 dubbelmärkning i Drosophila NBs, som inte kräver utfodring EdU till larver. En tidigare studie använde dubbel EdU/pH3 färgning för att analysera cellcykeln i NBs, men presenterade inte ett detaljerat protokoll4. Detta innebär ett onödigt hinder för labb som försöker implementera den här metoden. Dessutom kan det vara en tidskrävande process att utvärdera kompatibiliteten hos olika reagenser med EdU-satsen och utföra ytterligare optimering. Detta dokument presenterar ett steg-för-steg protokoll som täcker EdU införlivande i dissekerade larval hjärnor och immunostaining med anti-pH3 antikroppar, följt av confocal mikroskopi och bild analys för att fördela NBs till fyra distinkta kategorier: G0/G1 fas, S fas, S>G2/M (progression från S till G2/M) och M fas. Stegen som behöver optimering beskrivs och tips ges för avbildnings analys av stora data uppsättningar. Dessutom analyseras EdU/pH3-avläsningen i NB av vild typ och jämförs med Mms19P NBs, som nyligen rapporterades visa en cellcykelfördröjning11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#15477</td>
			<td>P-element insertion in the third exon of Mms19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td>
			<td>Generated in house</td>
			<td></td>
			<td>eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>#3605</td>
			<td>wild-type stock (w;+;+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Miranda</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab197788</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pH3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9701</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>112-165-167</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27034</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Imagej)</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graph pad software</td>
			<td>Version 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water-soluble, non-fluorescing mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

5-ethynyl-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 dual-labeling protocol for cell cycle progression analysis in drosophila neural stem cells

In vivo cellcykelprogressionsanalys utförs rutinmässigt i studier på gener som reglerar mitos och DNA-replikering. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) har använts för att undersöka replikativ/S-fas progression, medan antikroppar mot fosfo-histon H3 har använts för att markera mitotiska atomkärnor och celler. En kombination av båda etiketterna skulle möjliggöra klassificering av G0/G1 (Gap phase), S (replikativ) och M (mitotisk) faser och fungera som ett viktigt verktyg för att utvärdera effekterna av mitotiska gen knockdowns eller null mutanter på cellcykelprogression. De reagenser som används för att märka EdU-märkta celler är dock oförenliga med flera sekundära antikroppslysrör. Detta komplicerar immunstaining, där primära och märkta sekundära antikroppar används för att markera pH3-positiva mitotiska celler. Detta dokument beskriver ett steg-för-steg protokoll för dubbelmärkning av EdU och pH3 i Drosophila larval neurala stamceller, ett system som används i stor utsträckning för att studera mitotiska faktorer. Dessutom tillhandahålls ett protokoll för bildanalys och kvantifiering för att allokera märkta celler i 3 distinkta kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progression från S till G2/M) och M-faser.

Den bi-lobed Drosophila tredje instar larval hjärnan har använts som ett modellsystem för att studera grundläggande cellulära och utvecklingsmässiga processer9. Fokus för den aktuella studien var att presentera ett protokoll för analys av cellcykelprogression i EdU- och pH3-märkta NBs i CB-regionen (figur 1). CB NBs är indelade i typ I och typ II, och de visar det karakteristiska asymmetriska delningsmönstret9. Varje typ I N...

Watch this Scientific Journal Video about 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells at JoVE.com 

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells (Video) | JoVE 

Cellcykel analys med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) och phospho-histon H3 (pH3) märkning är en flera steg förfarande som kan kräva omfattande optimering. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver alla steg för denna procedur inklusive bildanalys och kvantifiering för att skilja celler i olika cellcykelfaser.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol för cellcykelprogressionsanalys i Drosophila neurala stamceller

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

I det här protokollet ger vi inte bara en detaljerad förklaring av varje steg i EDU-inkorporering och immunstaining, utan förklarar också bildförvärv, bildbehandling och ger några tips för att analysera stora datamängder. Denna teknik möjliggör allokering av celler i G1-, S- och M-faser. Detta kommer att vara särskilt användbart för cellcykelanalys av studier på icke-mutationer som påverkar mitotiska gener.Vi förväntar oss att människor kämpar i två till tre månader om de inte har förkunskaper eller erfarenhet av denna teknik. Till att börja med, lägg till Schneiders dissekeringsmedium eller SM till två på varandra följande fördjupningar av en glansfläckplatta och lägg till PBS till den efterföljande depressionen. Använd ett par tångar, plocka vandrande tredje instar larver och placera dem på en vävnad som är skramlad med PBS för att rengöra flugmatsrester.Placera larven i depressionen med PBS följt av den på varandra följande depressionen som innehåller SM. Använd sedan under ett dissekeringsmikroskop för att ta bort tre fjärdedelar av larvens underkropp. Ta sedan försiktigt tag i larvens munkrokar med ett par tångar och håll nagelbandet i den andra änden med det andra paret tång. Vänd larvhuvudet ut och in genom att trycka munkrokarna inåt och samtidigt skala av vävnaden i andra änden.Observera larvhjärnan med bifogade imaginala skivor. Ta bort andra vävnader som är fästa vid hjärnan och överför hjärnan till efterföljande efterföljande depression med SM. Tillsätt 100 mikroliter av 100 mikromolar EDU SM-lösning till en annan depression på Pyrex-plattan och inkubera cirka 5 till 10 dissekerade hjärnor i denna lösning i 2 timmar vid 25 grader Celsius. Efter fixering och immunstaining ta bort PBST och tillsätt EDU detektion cocktail till de dissekerade hjärnorna.Inkubera dem sedan vid rumstemperatur i mörkret på en neutater. Tvätta proverna två gånger med PBST i 10 minuter per tvätt i mörker efter 30 minuter. För DNA-färgning, förbered 5 mikrogram per milliliter Hoechst 33342-lösning.Ta bort PBST efter den andra tvätten och tillsätt 500 mikroliter av Hoechst-lösningen till de dissekerade hjärnorna och inkubera dem sedan i mörkret. Efter 10 minuter, ta bort Hoechst och tvätta proverna med PBST i 10 minuter. Knacka på röret på labbbänken och låt hjärnan slå sig ner.Ta bort PBST från röret och lämna efter dig 50 till 100 mikroliter. Skär änden av en 200 mikroliter mikropipetspets och använd den för att överföra hjärnan till en ren glasrutschbana. Ta bort åtkomst PBST från bilden genom att blotta den med filterpappersremsor.Låt inte filterpapperet vidröra hjärnan. Sätt en droppe vattenlösligt, icke fluorescerande monteringsmedium på hjärnan och orientera hjärnan så att ventrala nervsladden vetter mot rutschkanan och loberna är vända uppåt. Ordna hjärnan i en enda fil så att det är lättare att avbilda hjärnan seriellt.Placera försiktigt en täcklapp ovanpå hjärnan och inkubera glidningen över natten vid 2 till 6 grader Celsius. Välj 63 gånger målet från anskaffningsprogramvaran. Lägg en droppe nedsänkningsolja på täckslipen precis ovanför de monterade hjärnorna för att göra det lättare att hitta vävnaden genom okularet.Använd dappy Hoechst 33342-kanalen, hitta hjärnan genom okularet och byt sedan till förvärvsläget i programvaran. Ställ in 4 kanaler för att avbilda Hoechst 33342, Alexa våning 4 8 8, Alexa våning 5 6, 8 och Alexa golv 6 4 7. Använd färgassistentverktyget för att automatiskt ställa in de valda färgämnenas excitationslasrar och emissionsfilter.Ställ in synfältet, så att det omfattar hela hjärnloben. Föreställ dig hela volymen av hjärnloben genom att förvärva denna skatt med 0,8 mikron ifrån varandra. Lagra alla bilder från en bildsession i ett dot L I F-biblioteksformat.För bildanalys öppnar du Fiji och drar och släpper LIF-filerna till Fiji. Välj datawebbläsare på stackvisningsfliken och använd virtuell stack från fliken minneshantering i plugin-programmet för bioformat. Observera bilden med flera kanaler som visas i bild J.Ändra färgen på kanalerna från menyraden med hjälp av verktyget bild, färg och kanaler.Och övervaka Miranda-märkta neuroblaster, som visas som stora runda celler i den centrala hjärnregionen. Rita en region av intresse med hjälp av ellipsverktyget över varje neuroblast för att undvika att räkna neuroblast två gånger. Välj analys, verktyg och ROI-chef i menyraden bild J.Markera alla neuroblaster i det aktuella Z-avsnittet och tryck på T efter att ha markerat varje cell. När alla neuroblaster i det nuvarande Z-sektionen är markerade, ändra kanalerna till pH3 och EDU och räkna manuellt antalet EDU positiva neuroblaster, pH3 positiva neuroblaster, EDU och pH3 positiva neuroblaster, och neuroblaster inte färga för någon av markörer. Sök efter neuroblaster och efterföljande Z-sektioner, ta bort gamla ROM och lägg till nya ROM för att räkna neuroblaster i olika staplar.Förbered ett kalkylblad och beräkna procentandelar av neuroblaster som finns i alla fyra kategorierna för varje lob. Förbered ett stapeldiagram med hjälp av kalkylbladsprogramvaran som visar pooldata för procentandelar neuroblaster i varje kategori. Centrala hjärnneuroblaster från tredje instar larval hjärnor markerade med Miranda, EDU, och pH3 visas här.Cellerna tilldelades G1/G0-, S-, SG2/M- och M-faserna. I EDU pH3 analys, en betydligt högre andel av MMS19, förlust av funktion neuroblaster hittades i M-fasen jämfört med vilda typ neuroblaster. MMS19:eGFP-uttryck i MMS19 förlust av funktion bakgrund räddade andelen celler i M fas till vilda typ nivåer.Det är viktigt att inte använda skadade hjärnor för efterföljande steg. Och ED-lösningen bör beredas nyligen innan dissekeringar påbörjas. Denna tillgång kan användas som en snabb inledande screening för att identifiera defekter i specifika cellcykelfaser.Detta skulle sedan kunna följas upp av en mer detaljerad analys av en viss fas.

Research

JoVE Journal

Biology

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Counting Human Neural Stem Cells

Räkna mänskliga neurala stamceller

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immuncytokemi: Mänskliga neurala stamceller

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE 

Video Bioinformatik Analys av mänskliga embryonala stamceller Colony Tillväxt

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells (Video) | JoVE 

Analys av cellcykeln Position i däggdjursceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors (Video) | JoVE 

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) Using Retroviral Vector with GFP (Video) | JoVE 

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Mätning Cell Kinetics cellcykelreglering med metabolisk märkning och flödescytometri

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE 

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus (Video) | JoVE 

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR (Video) | JoVE 

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...