Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

نقدر جهود ليو جناتوفسكي في تحرير النص الإنجليزي لهذه المخطوطة. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في الولايات المتحدة (1R01HL109054) منحة للدكتور وانغ.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات والممارسات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ميشيغان. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات والممارسات التجريبية التي تنطوي على زراعة الخلايا BSL2 خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة. وفيما يتعل?...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

تقييم وظيفة iCMs ضروري لحقل إعادة برمجة القلب. في هذه المخطوطة، يصف البروتوكول سلالة TG (Myh6-cre)1Jmk/J/Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J Mouse التي تم إنشاؤها، وكيفية استخدام NCFs المعزولة عن الفئران الوليدية في هذه السلالة لإعادة برمجتها على iCMs، وتقييم وظيفة iCMs بواسطة تدفق Ca2+ . هذه طريقة de novo لتقيي?...

احتشاء عضلة القلب (MI) هو مرض شديد في جميع أنحاء العالم. أمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs) هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم وتسبب ما يقرب من 18.6 مليون حالة وفاة في عام 20191،2. وقد انخفض مجموع الوفيات الناجمة عن الأمراض القلبية الوعائية خلال نصف القرن الماضي. ومع ذلك، تباطأ هذا الاتجاه أو حتى انعكس في بعض البلدان غير المتطورة1، مما يدعو إلى علاجات أكثر فعالية للأمراض القلبية الوعائية. باعتبارها واحدة من المظاهر القاتلة للأمراض القلبية الوعائية، يمثل MI حوالي نصف جميع الوفيات المنسوبة إلى الأمراض القلبية الوعائية في الولايات المتحدة2. خلال نقص التروية ، مع انسداد الشرايين التاجية والعرض المحدود لكل من العناصر الغذائية والأوكسجين ، يعاني عضلة القلب من تغيرات استقلابية حادة ، ويضعف الوظيفة الانقباضية لخلايا القلب (CMs) ، ويؤدي إلى موت CM3. وقد تم استكشاف العديد من النهج في أبحاث القلب والأوعية الدموية لإصلاح إصابة القلب واستعادة وظيفة القلب المصاب4. ظهرت إعادة برمجة القلب المباشرة كاستراتيجية واعدة لإصلاح القلب التالف واستعادة وظيفته5،6. من خلال إدخال Mef2c، Gata4، Tbx5 (MGT)، يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى iCMs في المختبر وفي الجسم الحي، ويمكن لتلك iCMs تقليل منطقة ندبة وتحسين وظيفة القلب7،8.
على الرغم من أن إعادة برمجة القلب هي استراتيجية واعدة لعلاج MI ، لا يزال هناك عدد من التحديات. أولا، كفاءة إعادة البرمجة، والنقاء، والجودة ليست دائما عالية كما هو متوقع. يمكن أن يحقق إغراء MGT 8.4٪ فقط (cTnT+) أو 24.7٪ (αMHC-GFP+) من إجمالي CFs التي سيتم إعادة برمجتها على iCMs في المختبر7 ، أو ما يصل إلى 35٪ في vivo8 ، مما يحد من تطبيقها. حتى مع وجود المزيد من العوامل المستحثة في النظام ، مثل Hand29 أو Akt1 /PKB10 ، فإن كفاءة إعادة البرمجة لا تزال مرضية بالكاد لاستخدامها في بيئة سريرية. ومن ثم، يلزم إجراء المزيد من الدراسات التي تركز على تحسين كفاءة إعادة البرمجة في هذا المجال. ثانيا، تعتبر خصائص السلامة الكهربائية والانكماش لأجهزة iCMs مهمة لتحسين كفاءة وظائف القلب، ومع ذلك فإن تقييمها صعب. وفي الوقت الراهن، تركز أساليب التقييم المستخدمة على نطاق واسع في هذا المجال، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، والكيمياء المناعية، وqPCR لبعض التعبيرات الرئيسية لجينات CMs، على تشابه ال iCMs و CMs، ولكنها لا ترتبط مباشرة بالخصائص الوظيفية ل iCMs. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب لها إجراءات معقدة نسبيا وتستغرق وقتا طويلا. في حين أن دراسات إعادة البرمجة عادة ما تنطوي على فحص لعوامل إعادة البرمجة المحتملة التي تعزز نضوج iCMs11 ، تتطلب إعادة برمجة القلب طريقة سريعة ومريحة استنادا إلى وظيفة iCMs.
CMs فتح قنوات أيونات الكالسيوم ذات بوابات الجهد على السيتوميمبران خلال كل دورة التعاقد، مما يؤدي إلى تدفق عابر من أيون الكالسيوم (Ca2+) من السائل بين الخلايا إلى السيتوبلازم للمشاركة في انكماش myofilament. مثل هذا التدفق Ca2 + ودورة اللوكس هو السمة الأساسية للانكماش عضلة القلب ويشكل وظيفة طبيعية من CMs12. وبالتالي، فإن الطريقة التي تكتشف تدفق Ca2+ يمكن أن تكون طريقة محتملة لقياس وظيفة CMs والخلايا الشبيهة ب CM، بما في ذلك iCMs. وعلاوة على ذلك، بالنسبة لأجهزة iCMs، توفر هذه الطريقة طريقة أخرى لتقييم كفاءة إعادة البرمجة.
تم تطوير مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) واستخدامها على نطاق واسع للإشارة إلى أنشطة الخلية، وخاصة إمكانات العمل. عموما، GECIs تتكون من مجال ربط Ca2 + مثل كالمودولين، ومجال الفلورسنت مثل GFP، وGCaMP3 هو واحد مع تقارب عالية وكثافة مضان. سيتم تنشيط مجال الفلورسينس GCaMP3 عند تغيير تركيز الكالسيوم المحلي13. في هذه الورقة، يتم وصف سلالة الماوس التي تعبر على وجه التحديد مراسل GCaMP3 في خلايا Myh6+. من خلال إدخال MGT إلى NCFs المعزولة من حديثي الولادة من هذه السلالة ، يمكن مراقبة إعادة البرمجة عن طريق الفلور ، والتي سيتم عرضها بنجاح iCMs المبرمجة. مثل هذه السلالة الماوس وطريقة سوف توفر منصة قيمة للتحقيق في إعادة برمجة القلب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

أصبحت إعادة برمجة القلب علاجا واعدا لإصلاح القلب التالف. من خلال إدخال عوامل نسخ متعددة ، بما في ذلك Mef2c ، Gata4 ، Tbx5 (MGT) ، يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية في خلايا القلب المستحثة (iCMs). هذه iCMs، عندما ولدت في الموقع في قلب متشح، ودمج كهربائيا وميكانيا مع عضلة القلب المحيطة بها، مما يؤدي إلى انخفاض في حجم ندبة وتحسين في وظيفة القلب. ونظرا للانخفاض النسبي في كفاءة إعادة البرمجة ونقاوتها وجودتها، فإن توصيف الأجهزة iCMs يظل تحديا. تركز الأساليب المستخدمة حاليا في هذا المجال، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي والكيمياء المناعية وqPCR، بشكل رئيسي على التعبير الجيني والبروتيني الخاص بالقلب ولكن ليس على النضج الوظيفي ل iCMs. يؤدي فتح قنوات الكالسيوم ذات بوابات الجهد في خلايا القلب إلى تدفق سريع للكالسيوم إلى الخلية بسبب إمكانات العمل. لذلك ، فإن تحديد معدل تدفق الكالسيوم هو طريقة واعدة لتقييم وظيفة القلب. هنا، يقدم البروتوكول طريقة لتقييم وظيفة iCM عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+). تم تأسيس سلالة ماوس αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 من خلال عبور Tg (Myh6-cre)1Jmk/J (يشار إليه باسم Myh6-Cre أدناه) مع Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليها باسم Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) الفئران. تم عزل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) من فئران حديثي الولادة P0-P2 واستزراعها في المختبر ، وتم إدخال بناء متعدد الحسابات ل MGT إلى NCFs ، مما أدى إلى إعادة برمجتها إلى iCMs. لأن فقط إعادة برمجة iCMs بنجاح سوف تعبر عن مراسل GCaMP3، يمكن تقييم النضج الوظيفي لل iCMs بصريا من خلال تدفق Ca2+ مع المجهر الفلوري. وبالمقارنة مع الصناديق غير المبرمجة، أظهرت NCF-iCMs تدفقا عابرا كبيرا للكالسيوم وانكماشا عفويا، على غرار CMs. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل إنشاء سلالة الماوس وعزل واختيار قلوب الفئران الوليدية وعزلة NCF وإنتاج الفيروس الرجعية لإعادة برمجة القلب ، وحث iCM ، وتقييم تدفق iCM Ca2 + باستخدام خط المراسل الخاص بنا ، والتحليل الإحصائي ذي الصلة وعرض البيانات. ومن المتوقع أن توفر الأساليب الموصوفة هنا منصة قيمة لتقييم النضج الوظيفي ل iCMs لدراسات إعادة برمجة القلب.

ويظهر في الشكل 1 سير العمل التجريبي لتوليد Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 سلالة الفئران والبنية الجينية للفئران المعدلة وراثيا. في حين يتم تأسيس سلالة الماوس ، تم عزل قلوب الجراء ومراقبتها تحت مجهر مضان عكسي لتأكيد النمط الجيني. قلوب مع النمط الجيني الصحيح تظهر Ca2 + تدفق متزامن...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

نحن نصف هنا، إنشاء وتطبيق TG (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليه باسم αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) خط مراسل الماوس لتقييم إعادة برمجة القلب. يتم تحويل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) المعزولة عن سلالة الماوس إلى خلايا قلبية مستحثة (iCMs) ، مما يسمح بتقييم مناسب وفعال لكفاءة إعادة البرمجة والنضج الوظيفي ل iCMs عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+).

في المختبر تقييم إعادة برمجة القلب عن طريق قياس تدفق الكالسيوم القلب محددة مع مراسل GCaMP3

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

ستوفر الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول منصة قيمة لتقييم النضج الوظيفي ل ICMs لدراسات إعادة برمجة القلب. يتم مراقبة تدفق الكالسيوم حصريا في ICMs ويوفر طريقة لتقييم النضج الوظيفي ICM. هذه السلالة الماوس يبسط إجراءات التقييم ويعزز استنساخ النتائج.هذا البروتوكول هو طريقة جديدة لتقييم النضج الوظيفي ICMs في مجال إعادة برمجة القلب. ويمكن أيضا أن تطبق لتقييم التمايز cardiomyocyte ووظيفة القلب. ابدأ بالحصول على ثمانية إلى عشرة جراء، جرو P0 إلى P2 لعزل 10 ملايين من الخلايا الليفية القلبية الوليدية، أو NCFs.تخدير عميق للجراء عن طريق انخفاض حرارة الجسم. مراقبة قلوب تحت المجهر الفلوري لضمان أن القلب مع النمط الجيني المطلوب يظهر تدفق الكالسيوم، وأشار GCaMP3 مع قلوب ينبض. الأنماط الجينية الأخرى لن تظهر الفلورسينس.بعد عزلة القلوب، قطعها إلى أربع قطع بحيث تكون متصلة بشكل فضفاض. غسلها جيدا عدة مرات في الجليد الباردة دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة، أو DPBS، في لوحة ستة سنتيمتر للحد من تلوث خلايا الدم في الخلايا المعزولة. هضم القلوب مع ثمانية ملليلتر من الحارة 0.25٪ تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.تجاهل التريبسين الفائق وإضافة خمسة ملليلتر من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر نوع دافئ اثنين collagenase في محلول الملح المتوازن هانك. دوامة الخليط جيدا واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، مرة أخرى، دوامة الخليط جيدا والسماح للأنسجة غير المهضومة يستقر بالجاذبية.جمع supernatant في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من المتوسطة الليفية الباردة. تمييع الخلايا مع متوسطة الخلايا الليفية بحيث كثافة البذر حوالي في 2-2.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مكعب. ثم بذر الخلايا في أطباق أو لوحات.يجب أن يكون للخلايا الليفية المرفقة شكل بيضاوي إلى مستدير في اليوم الثاني بعد البذر. في اليوم صفر، بذور NCFs إلى كثافة حوالي 1-2 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مكعب في وسط الخلايا الليفية. في يوم واحدة يستبدل واحدة الثقافة وسط مع فيروس يحتوي وسط لكل جيدا بما أن يشد.في اليوم الثاني، بعد 24 ساعة من الإصابة بالفيروس، استبدل الفيروس الذي يحتوي على وسيط بوسط ICM منتظم. تقييم تدفق أيونات الكالسيوم مع مجهر مضان مقلوب في درجة حرارة الغرفة. مراقبة الخلايا الإيجابية GCaMP3 تحت الهدف 10X، وضمان أنه يظهر الخلايا العفوية الضرب في قناة برايتفيلد.وأظهرت قلوب مع النمط الجيني الصحيح تدفق أيون الكالسيوم متزامنة مع الضرب، تصور كما flourescence GCaMP3. في حين لم يلاحظ أي مضان في قلوب السيطرة. NCFs معزولة تعلق على البئر في غضون ساعتين وأظهرت شكل بيضاوي إلى مستدير بعد يوم واحد من البذر.أظهر تذبذب أيون الكالسيوم تغيرا في الفلورية GCaMP3 بين الحد الأقصى والحد الأدنى وتغير تذبذب أيون الكالسيوم في مثل هذه الخلايا بشكل دوري. بعد إدخال IMAP ، كان عدد مجموعات الضرب أعلى بكثير من ذلك في المجموعة الخاضعة للرقابة حيث تم زيادة عدد الخلايا الإيجابية GCaMP3 مع تدفق أيونات الكالسيوم لحقل عالي الطاقة في المجموعة المعالجة المتوسطة IMAP. يجب أن تكون NCFs معدة حديثا وصحية بعد العزلة.يمكن أن يساعد الإجراء السريع لعزل القلب والقطع ووقت الهضم المناسب على تجنب الحد من صلاحية الخلايا وحالتها. توفر هذه الطريقة طريقة لتحديد ICMs الناضجة وظيفيا للباحثين في إعادة برمجة القلب. مع العديد من أساليب التقييم الأخرى ، يمكن للمرء الحصول على فهم أكثر إيجازا حول ICMs الناضجة وظيفية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

القلب اختبار الاجهاد الناجم عن الدوبوتامين ومراقبتها من قبل القسطرة القلبية في الفئران

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

قياس القلب العصبي المستقل نظام (ANS) نشاط في الأطفال

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

تقييم البطين الأيمن هيكل وظيفة في نموذج الفأر من الشريان الرئوي عبر الصدر عن طريق انقباض ضربات القلب

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

تقييم موسع من القلب شذوذ في التجريبية المناعة الذاتية التهاب عضلة القلب بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي المجهر في ماوس

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

الاستقراء وتقييم الإصابة الإسكيمية-ضخه في Langendorff perfused لالجرذ القلوب

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

تقييم القلب المورفولوجية والوظيفية التغييرات في الفأر نموذج من مستعرض الأورطي انقباض بواسطة تخطيط صدى القلب التصوير

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

تقييم تخطيط صدي لتشريح القلب ووظيفته في الفئران البالغة

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

في المختبر تقييم وظيفة القلب باستخدام خلايا القلب skinned

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

تقييم البطينين لوظيفة القلب وحلقات حجم الضغط عن طريق قسطرة الصدر المغلقة في الفئران

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...