Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Vi sætter pris på Leo Gnatovskiys indsats for at redigere den engelske tekst til dette manuskript. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) tilskud til Dr. Wang.

Alle forsøgsprocedurer og praksis, der involverer dyr, blev godkendt af Institutional Animal Care &Use Committee på University of Michigan. Alle forsøgsprocedurer og -praksisser, der involverer cellekultur, skal udføres BSL2 Biological Safety Cabinet under sterile forhold. For de procedurer og praksis, der involverer virus, retningslinjen for korrekt bortskaffelse af transfected celler, pipette tips, og rør for at undgå risikoen for miljø-og sundhedsrisici blev fulgt.
1. Etablering af en ...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Evaluering af iCMs funktion er nødvendig for hjerte omprogrammering felt. I dette manuskript beskriver protokollen en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musestamme, der er blevet etableret, hvordan man bruger NCF'erne isoleret fra neonatale mus i denne stamme til omprogrammering til iMP'er og evaluering af iMP'er funktion ved Ca2+ flux. Dette er en de novo metode til at evaluere iCMs funktionelle modning.
Flere kritiske trin er vigtige for en...

Myokardieinfarkt (MI) er en alvorlig sygdom på verdensplan. Hjerte-kar-sygdomme (CVD'er) er den hyppigste dødsårsag på verdensplan og tegner sig for ca. 18,6 millioner dødsfald i 20191,2. Den samlede dødelighed af CVD'er er faldet i løbet af det sidste halve århundrede. Denne tendens er imidlertid blevet bremset eller endog vendt i nogle uudviklede lande1, hvilket kræver mere effektive behandlinger af CVD'er. Som en af de fatale manifestationer af CVD, MI tegner sig for omkring halvdelen af alle dødsfald tilskrives CVD'er i USA2. Under iskæmien, med blokering af kranspulsårer og begrænset forsyning af både næringsstoffer og ilt, myokardiet lider alvorlige metaboliske ændringer, forringer den systoliske funktion af kardiomyocytter (DM'er), og fører til CM death3. Talrige tilgange i hjerte-kar-forskning er blevet undersøgt for at reparere hjerteskade og genoprette funktionen af den skadede hjerte4. Direkte hjerte omprogrammering har vist sig som en lovende strategi for at reparere det beskadigede hjerte og genoprette sin funktion5,6. Ved at indføre Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblaster kan omprogrammeres til iCMs in vitro og in vivo, og disse iCMs kan reducere arområdet og forbedre hjertefunktionen7,8.
Selvom omprogrammering af hjertet er en lovende strategi for MI-behandling, er der stadig en række udfordringer. For det første er omprogrammeringseffektivitet, renhed og kvalitet ikke altid så høj som forventet. MGT-tilskyndelse kan kun opnå 8,4 % (cTnT+) eller 24,7 % (αMHC-GFP+) af de samlede CF'er, der skal omprogrammeres til iCMs in vitro7, eller op til 35 % in vivo8, hvilket begrænser anvendelsen heraf. Selv med flere faktorer induceret i systemet, såsom Hand29 eller Akt1/PKB10, er omprogrammeringseffektiviteten stadig næppe tilfredsstillende at blive brugt i kliniske omgivelser. Der er således behov for flere undersøgelser med fokus på at forbedre omprogrammeringseffektiviteten på dette område. For det andet er iMP'ernes elektriske integritet og sammentrækningskarakteristika vigtige for en effektiv forbedring af hjertefunktionen, men disse er udfordrende at evaluere. I øjeblikket er udbredte evalueringsmetoder på området, herunder flowcytometri, immunocytokemi og qPCR af nogle vigtige CMs-genersekspression, alle fokuseret på ligheden mellem iCMs og CMs, men ikke direkte relateret til de funktionelle egenskaber ved iCMs. Desuden har disse metoder relativt komplicerede procedurer og er tidskrævende. Mens omprogrammering undersøgelser normalt indebærer en screening af potentielle omprogrammering faktorer, der fremmer iCMs modning11, hjerte omprogrammering opfordrer til en hurtig og bekvem metode baseret på iCMs funktion.
CMs åbne spænding-gated calcium ion kanaler på cytomembrane i løbet af hver ordregivende cyklus, hvilket fører til en forbigående tilstrømning af calcium ion (Ca2 +) fra den intercellulære væske til cytoplasma at deltage i myofilament sammentrækning. En sådan Ca2 + tilstrømning og outflux cyklus er det grundlæggende træk ved myokardiesammentrækning og udgør den normale funktion af CMs12. Således kan en metode, der registrerer Ca2 + tilstrømning være en potentiel måde at måle funktionen af DM'er og CM-lignende celler, herunder iCMs. For iCMs giver en sådan metode desuden en anden måde at evaluere omprogrammeringseffektiviteten på.
Genetisk kodede calciumindikatorer (GEFI'er) er blevet udviklet og i vid udstrækning anvendt til at angive celleaktiviteter, især handlingspotentialer. Generelt består GEFI'er af et Ca2+- bindingsdomæne som calmodulin, og et fluorescerende domæne som GFP, og GCaMP3 er et med høj affinitets- og fluorescensintensitet. GCaMP3's fluorescensdomæne aktiveres, når den lokale calciumkoncentration ændres13. I dette papir, en mus stamme, der specifikt udtrykker en GCaMP3 reporter i Myh6 + celler er beskrevet. Ved at indføre MGT til de isolerede NCF'er fra nyfødte af denne stamme, kan omprogrammeringen overvåges af fluorescens, som med succes omprogrammeres iCMs vil udstille. En sådan musestamme og -metode vil give en værdifuld platform til at undersøge hjerte omprogrammering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

Hjerte omprogrammering er blevet en potentielt lovende terapi til at reparere et beskadiget hjerte. Ved at indføre flere transskription faktorer, herunder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblaster kan omprogrammeres til induceret kardiomyocytter (iCMs). Disse iCMs, når de genereres in situ i et infarkt hjerte, integrere elektrisk og mekanisk med det omgivende myokardie, hvilket fører til en reduktion i arstørrelse og en forbedring i hjertefunktionen. På grund af den relativt lave omprogrammering effektivitet, renhed og kvalitet af iCMs, karakterisering af iCMs er fortsat en udfordring. De aktuelt anvendte metoder på dette område, herunder flowcytometri, immunocytokemi og qPCR, fokuserer primært på hjertespecifikt gen- og proteinekspression, men ikke på den funktionelle modning af iCMs. Udløst af handling potentialer, åbningen af spænding-gated calcium kanaler i kardiomyocytter fører til en hurtig tilstrømning af calcium ind i cellen. Derfor er kvantificering af calciumtilstrømningen en lovende metode til at evaluere kardiomyocytfunktion. Her introducerer protokollen en metode til at evaluere iCM-funktionen ved calcium (Ca2+) flux. En αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme blev etableret ved at krydse Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (kaldet Myh6-Cre nedenfor) med Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (benævnt Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) mus. Neonatale hjertefibroblaster (NCF'er) fra P0-P2 neonatale mus blev isoleret og kultiveret in vitro, og en polycistronisk konstruktion af MGT blev introduceret til NCF'er, hvilket førte til deres omprogrammering til iCMs. Fordi kun med succes omprogrammeret iCMs vil udtrykke GCaMP3 reporter, den funktionelle modning af iMP'er kan visuelt vurderes af Ca2 + flux med fluorescens mikroskopi. Sammenlignet med ikke-omprogrammerede NCF'er viste NCF-iMP'er signifikant calciumtransient flux og spontan sammentrækning, svarende til CMs. Denne protokol beskriver i detaljer musen stamme etablering, isolation og udvælgelse af neonatale mus hjerter, NCF isolation, produktion af retrovirus til hjerte omprogrammering, iCM induktion, evaluering af iCM Ca2 + flux ved hjælp af vores reporter linje, og relaterede statistiske analyse og data præsentation. Det forventes, at de metoder, der er beskrevet her, vil give en værdifuld platform til at vurdere den funktionelle modning af iCMs til hjerte omprogrammeringsundersøgelser.

Den eksperimentelle arbejdsgang til generering af Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme og genstrukturen af de transgene mus er vist i figur 1. Mens musestammen er etableret, blev hvalpenes hjerter isoleret og observeret under et omvendt fluorescensmikroskop for at bekræfte genotypen. Hjerter med korrekt genotype viser Ca2+ flux synkroniseret med slå, visualiseret som GCaMP3 fluorescens, mens der ikke blev observeret fluorescens i kontrolhjerter (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Vi beskriver her etableringen og anvendelsen af en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (benævnt αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) musereporterlinje til omprogrammering af hjerte. Neonatale hjertefibroblaster (NCF'er) isoleret fra musestammen omdannes til inducerede kardiomyocytter (iCMs), hvilket giver mulighed for bekvem og effektiv evaluering af omprogrammeringseffektivitet og funktionel modning af iCMs via calcium (Ca2+) flux.

In vitro vurdering af hjerte omprogrammering ved måling af hjertespecifik calciumflux med en GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Metoder, der er beskrevet i denne protokol, vil give en værdifuld platform til at vurdere den funktionelle modning af ICMs til hjerte omprogrammeringsundersøgelser. Calciumfluxen observeres udelukkende i IMS og giver en måde at evaluere ICM funktionel modning. Denne musestamme forenkler evalueringsprocedurerne og forbedrer reproducerbarheden af resultaterne.Denne protokol er en ny metode til at evaluere ICM'ers funktionelle modning i omprogrammeringsfeltet til hjerte. Det kan også anvendes til at evaluere kardiomyocyt differentiering og hjertefunktion. Begynd med at få otte til 10 hvalpe, P0 til P2 hvalpe til at isolere 10 millioner neonatale hjerte fibroblaster, eller NCF'er.Dybt bedøve hvalpene ved hypotermi. Overhold hjerterne under fluorescensmikroskopet for at sikre, at hjertet med den ønskede genotype viser calciumstrøm, angivet af GCaMP3 med hjerterne slå. De andre genotyper vil ikke vise fluorescens.Efter isolering af hjerterne, skære dem i fire stykker, således at de er løst forbundet. Vask dem grundigt flere gange i iskold Dulbeccos fosfatbufferede saltvand, eller DPBS, i en seks centimeter plade for at begrænse blodcelleforureningen i de isolerede celler. Fordøje hjerter med otte milliliter af varme 0,25% Trypsin-EDTA i 37 grader Celsius i 10 minutter.Kassér Trypsin supernatant og tilsæt fem milliliter på 0,5 milligram pr milliliter varm type to kollagen i Hanks afbalancerede saltopløsning. Vortex blandingen grundigt og inkuberet ved 37 grader Celsius i fem minutter. Efter inkubationen hvirvler blandingen igen grundigt og lader det ufordøjede væv slå sig ned ved tyngdekraften.Saml supernatant i en 15 milliliter konisk rør med fem milliliter af kold fibroblast medium. Fortynd cellerne med fibroblast medium således, at såning densitet er omkring på to til 2,5 gange 10 til de fjerde celler pr kubikcentimeter. Så frø cellerne i opvask eller tallerkener.De vedhæftede fibroblaster skal have en oval til rund form på den anden dag efter såning. På dag nul, så NCF'erne til tætheden på omkring en til to gange 10 til de fjerde celler pr. kubikcentimeter i fibroblast medium. På dag ét erstatte kulturmediet med en virus, der indeholder medium for hver godt som ønsket.På dag 2, 24 timer efter virusinfektionen, erstatte virus indeholdende medium med en regelmæssig ICM medium. Vurder calciumionfluxen med et omvendt fluorescensmikroskop ved stuetemperatur. Overhold GCaMP3 positive celler under 10X mål, at sikre, at det viser spontane celler slå i brightfield kanal.Hjerter med den korrekte genotype viste calciumion flux synkroniseret med slå, visualiseret som GCaMP3 flourescens. Mens der ikke blev observeret fluorescens i kontrolhjerter. Isolerede NCF'er fastgjort til brønden inden for to timer og viste en oval til rund form en dag efter såning.Calciumionsvingningerne viste, at GCaMP3 fluorescensændringen mellem maksimums- og minimumskravet og calciumionsvingningerne i sådanne celler ændrede sig med jævne mellemrum. Efter at have indført IMAP var antallet af slåklynger betydeligt højere end i den kontrollerede gruppe, da antallet af GCaMP3 positive celler med calciumionstrøm til et højeffektfelt blev øget i IMAP medium behandlet gruppe. NCF'er skal være frisklavede og sunde efter isolation.En hurtig procedure for hjerte isolation, skæring, og ordentlig fordøjelsestid kan bidrage til at undgå reduktion i celle levedygtighed og tilstand. Denne metode giver en måde at identificere funktionelle matureret ICMs for hjerte omprogrammering forskere. Med flere yderligere evalueringsmetoder kan man få en mere kortfattet forståelse af funktionelle maturerede IMS.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Cardiac Stress Test induceret af Dobutamin og overvåges af hjertekateterisation i mus

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Måling Cardiac autonome nervesystem (ANS) Aktivitet i Børn

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Vurdering af Højre ventrikels struktur og funktion i musemodel med lungepulsåren Konstriktion af Transtorakal Ekkokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Noninvasiv Vurdering af abnormaliteter i hjertet i Experimental Autoimmune myocarditis ved Magnetic Resonance Imaging Microscopy i mus

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion og vurdering af iskæmi-reperfusion skade i Langendorff-perfusionerede rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Vurdering af Cardiac Morfologisk og funktionelle ændringer i musemodel for Tværgående pulsåresammensnøring ved ekkokardiografisk Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Ekkokardiografisk vurdering af hjertets anatomi og funktion hos voksne rotter

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Biventrikulær vurdering af hjertefunktion og trykvolumensløjfer ved lukket brystkateterisering hos mus

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...