Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

We waarderen de inspanningen van Leo Gnatovskiy bij het redigeren van de Engelse tekst van dit manuscript. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) van de Verenigde Staten (1R01HL109054) subsidie aan Dr. Wang.

Alle experimentele procedures en praktijken met dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care & Use Committee van de Universiteit van Michigan. Alle experimentele procedures en praktijken met celkweek moeten worden uitgevoerd BSL2 Biologische Veiligheidskast onder steriele omstandigheden. Voor de procedures en praktijken met betrekking tot virussen werd de richtlijn van de juiste verwijdering van getransfecteerde cellen, pipetpunten en buizen gevolgd om het risico van milieu- en gezondheidsrisico's te voor...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Het evalueren van de iCM-functie is noodzakelijk voor het cardiale herprogrammeringsveld. In dit manuscript beschrijft het protocol een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J muizenstam die is vastgesteld, hoe de NPF's geïsoleerd uit de neonatale muizen in deze stam te gebruiken voor de herprogrammering naar iCM's, en de evaluatie van de iCM-functie door Ca2+ flux. Dit is een de novo methode om de functionele rijping van iCM's te evalueren.
Versc...

Myocardinfarct (MI) is wereldwijd een ernstige ziekte. Hart- en vaatziekten (CVD's) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en zijn goed voor ongeveer 18,6 miljoen sterfgevallen in 20191,2. De totale sterfte van CVD's is de afgelopen halve eeuw afgenomen. Deze trend is echter vertraagd of zelfs gekeerd in sommige onontwikkelde landen1, wat vraagt om effectievere behandelingen van HVZ. Als een van de fatale manifestaties van HVZ is MI goed voor ongeveer de helft van alle sterfgevallen die worden toegeschreven aan HVZ in de Verenigde Staten2. Tijdens de ischemie, met de blokkering van kransslagaders en beperkte toevoer van zowel voedingsstoffen als zuurstof, lijdt het myocardium aan ernstige metabole veranderingen, schaadt het de systolische functie van cardiomyocyten (CMs) en leidt het tot CM-dood3. Talrijke benaderingen in cardiovasculair onderzoek zijn onderzocht om hartletsel te herstellen en de functie van het gewonde hart te herstellen4. Directe hartherprogrammering is naar voren gekomen als een veelbelovende strategie om het beschadigde hart te herstellen en de functie ervan te herstellen5,6. Door de introductie van Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kunnen fibroblasten in vitro en in vivo worden geherprogrammeerd naar iCM's, en die iCM's kunnen het littekengebied verminderen en de hartfunctie verbeteren7,8.
Hoewel hartherprogrammering een veelbelovende strategie is voor MI-behandeling, blijven er een aantal uitdagingen. Ten eerste zijn de herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit niet altijd zo hoog als verwacht. MGT-inducering kan slechts 8,4% (cTnT+) of 24,7% (αMHC-GFP+) van de totale CF's bereiken die in vitro naar iCM's moeten worden geherprogrammeerd7, of tot 35% in vivo8, wat de toepassing ervan beperkt. Zelfs met meer factoren geïnduceerd in het systeem, zoals Hand29 of Akt1 / PKB10, is de herprogrammeringsefficiëntie nog steeds nauwelijks bevredigend om in een klinische omgeving te worden gebruikt. Daarom zijn er meer studies nodig die gericht zijn op het verbeteren van de herprogrammeringsefficiëntie op dit gebied. Ten tweede zijn de elektrische integriteit en contractiekenmerken van iCM's belangrijk voor de efficiënte verbetering van de hartfunctie, maar deze zijn een uitdaging om te evalueren. Momenteel zijn veelgebruikte evaluatiemethoden in het veld, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR van enkele belangrijke CMs-genenexpressie, allemaal gericht op de gelijkenis van iCM's en CMs, maar niet direct gerelateerd aan de functionele kenmerken van iCM's. Bovendien hebben die methoden relatief ingewikkelde procedures en zijn ze tijdrovend. Terwijl herprogrammeringsstudies meestal een screening van potentiële herprogrammeringsfactoren omvatten die de rijping van iCM's bevorderen11, vereist cardiale herprogrammering een snelle en handige methode op basis van de iCM-functie.
CMs openen de spanningsafhankelijke calciumionkanalen op het cytomembraan tijdens elke contracteringscyclus, wat leidt tot een voorbijgaande instroom van calciumion (Ca2 +) van de intercellulaire vloeistof naar het cytoplasma om deel te nemen aan de myofilamentcontractie. Zo'n Ca2+ instroom- en outfluxcyclus is de fundamentele eigenschap van myocardiale contractie en vormt de normale functie van CMs12. Een methode die Ca2+ instroom detecteert, zou dus een mogelijke manier kunnen zijn om de functie van CM's en CM-achtige cellen, waaronder iCM's, te meten. Bovendien biedt een dergelijke methode voor iCM's een andere manier om de efficiëntie van herprogrammering te evalueren.
Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) zijn ontwikkeld en op grote schaal gebruikt om celactiviteiten aan te geven, met name actiepotentialen. Over het algemeen bestaan GECI's uit een Ca2 + bindend domein zoals calmodulin en een fluorescerend domein zoals GFP, en GCaMP3 is er een met een hoge affiniteit en fluorescentie-intensiteit. Het fluorescentiedomein van GCaMP3 wordt geactiveerd wanneer de lokale calciumconcentratie wordt gewijzigd13. In dit artikel wordt een muizenstam beschreven die specifiek een GCaMP3-verslaggever in Myh6+ cellen tot expressie brengt. Door MGT te introduceren in de geïsoleerde NCF's van pasgeborenen van deze stam, kan de herprogrammering worden gevolgd door fluorescentie, die met succes geherprogrammeerde iCM's zal vertonen. Zo'n muizenstam en -methode zal een waardevol platform bieden om cardiale herprogrammering te onderzoeken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

Hartherprogrammering is een potentieel veelbelovende therapie geworden om een beschadigd hart te herstellen. Door meerdere transcriptiefactoren te introduceren, waaronder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kunnen fibroblasten worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's). Deze iCM's, wanneer ze in situ worden gegenereerd in een infarcthart, integreren elektrisch en mechanisch met het omringende myocardium, wat leidt tot een vermindering van de littekengrootte en een verbetering van de hartfunctie. Vanwege de relatief lage herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit van de iCM's blijft de karakterisering van iCM's een uitdaging. De momenteel gebruikte methoden op dit gebied, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR, richten zich voornamelijk op hartspecifieke gen- en eiwitexpressie, maar niet op de functionele rijping van iCM's. Getriggerd door actiepotentialen, leidt het openen van spanningsafhankelijke calciumkanalen in cardiomyocyten tot een snelle instroom van calcium in de cel. Daarom is het kwantificeren van de snelheid van calciuminstroom een veelbelovende methode om de cardiomyocytenfunctie te evalueren. Hier introduceert het protocol een methode om de iCM-functie te evalueren door calcium (Ca2 +) flux. Een αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam werd vastgesteld door Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (hierna Myh6-Cre genoemd) te kruisen met Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (hierna Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genoemd) muizen. Neonatale cardiale fibroblasten (NCF's) van P0-P2 neonatale muizen werden geïsoleerd en in vitro gekweekt, en een polycistronische constructie van MGT werd geïntroduceerd bij NPF's, wat leidde tot hun herprogrammering naar iCM's. Omdat alleen succesvol geherprogrammeerde iCM's de GCaMP3-reporter tot expressie brengen, kan de functionele rijping van iCM's visueel worden beoordeeld door Ca2 + flux met fluorescentiemicroscopie. Vergeleken met niet-geherprogrammeerde NKK's vertoonden NCF-iCM's een significante calciumtransiënte flux en spontane contractie, vergelijkbaar met CM's. Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van muizenstam, isolatie en selectie van neonatale muizenharten, NCF-isolatie, productie van retrovirus voor cardiale herprogrammering, iCM-inductie, de evaluatie van iCM Ca2 + flux met behulp van onze reporterlijn en gerelateerde statistische analyse en gegevenspresentatie. Verwacht wordt dat de hier beschreven methoden een waardevol platform zullen bieden om de functionele rijping van iCM's voor cardiale herprogrammeringsstudies te beoordelen.

De experimentele workflow voor het genereren van Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam en de genstructuur van de transgene muizen is weergegeven in figuur 1. Terwijl de muizenstam is vastgesteld, werden de harten van de pups geïsoleerd en waargenomen onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om het genotype te bevestigen. Harten met correct genotype tonen Ca2+ flux gesynchroniseerd met kloppen, gevisualiseerd als GCaMP3 fluorescentie, terwijl er geen fluorescentie ...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux mogelijk is.

In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Methoden die in dit protocol worden beschreven, zullen een waardevol platform bieden om de functionele rijping van ICM's voor cardiale herprogrammeringsstudies te beoordelen. De calciumflux wordt uitsluitend waargenomen in ICM's en biedt een manier om de functionele rijping van ICM te evalueren. Deze muizenstam vereenvoudigt de evaluatieprocedures en verbetert de reproduceerbaarheid van de resultaten.Dit protocol is een nieuwe methode om de functionele rijping van ICM's in het veld van cardiale herprogrammering te evalueren. Het kan ook worden toegepast om cardiomyocytendifferentiatie en hartfunctie te evalueren. Begin met het verkrijgen van acht tot 10 pups, P0 tot P2 pups om 10 miljoen neonatale cardiale fibroblasten of NCF's te isoleren.Verdoof de pups diep door onderkoeling. Observeer de harten onder de fluorescentiemicroscoop om ervoor te zorgen dat het hart met het gewenste genotype calciumflux vertoont, aangegeven door GCaMP3 met kloppende harten. De andere genotypen vertonen geen fluorescentie.Na isolatie van de harten, snijd ze in vier stukken zodat ze losjes met elkaar verbonden zijn. Was ze meerdere keren grondig in ijskoude Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing, of DPBS, in een plaat van zes centimeter om de bloedcelvervuiling in de geïsoleerde cellen te beperken. Verteer de harten met acht milliliter warme 0,25% Trypsine-EDTA in 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi het Trypsin-supernatant weg en voeg vijf milliliter van 0,5 milligram per milliliter warm type twee collagenase toe aan de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank. Vortex het mengsel grondig en geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na de incubatie, opnieuw, vortex het mengsel grondig en laat het onverteerde weefsel bezinken door de zwaartekracht.Verzamel het supernatant in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter koud fibroblastmedium. Verdun de cellen met fibroblastmedium zodanig dat de zaaidichtheid ongeveer twee tot 2,5 keer 10 tot de vierde cel per kubieke centimeter bedraagt. Zaai vervolgens de cellen in gerechten of borden.De aangehechte fibroblasten moeten op de tweede dag na het zaaien een ovale tot ronde vorm hebben. Zaai op dag nul de NCF's tot de dichtheid van ongeveer één tot twee keer 10 tot de vierde cel per kubieke centimeter in fibroblastmedium. Vervang op dag één het kweekmedium door een virusbevattend medium voor elke put naar wens.Vervang op dag 2, 24 uur na de virusinfectie, het virusbevattende medium door een regulier ICM-medium. Beoordeel de calciumionenflux met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij kamertemperatuur. Observeer de GCaMP3-positieve cellen onder het 10X-objectief en zorg ervoor dat het spontane cellen laat zien die kloppen in het brightfield-kanaal.Harten met het juiste genotype vertoonden calciumionenflux gesynchroniseerd met kloppen, gevisualiseerd als GCaMP3-flourescentie. Terwijl er geen fluorescentie werd waargenomen in controleharten. Geïsoleerde NCP's bevestigden zich binnen twee uur aan de put en vertoonden een dag na het zaaien een ovale tot ronde vorm.De calciumionenoscillatie vertoonde GCaMP3-fluorescentieverandering tussen het maximum en het minimum en de calciumionoscillatie van dergelijke cellen veranderde periodiek. Na de introductie van IMAP was het aantal kloppende clusters significant hoger dan dat in de gecontroleerde groep, aangezien het aantal GCaMP3-positieve cellen met calciumionenflux voor een hoogvermogensveld was toegenomen in de met IMAP-medium behandelde groep. NPF's moeten vers worden bereid en gezond zijn na isolatie.Een snelle procedure van hartisolatie, snijden en een goede verteringstijd kan helpen om vermindering van de levensvatbaarheid en conditie van de cel te voorkomen. Deze methode biedt een manier om functioneel gerijpte ICM's te identificeren voor cardiale herprogrammeringsonderzoekers. Met meerdere verdere evaluatiemethoden kan men een beknopter begrip krijgen van functionele gerijpte ICM's.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Cardiac Stress Test geïnduceerd door dobutamine en bewaakt door hartkatheterisatie in Muizen

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Meten Cardiac autonome zenuwstelsel (ANS) Activiteit bij kinderen

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Beoordeling van de rechter ventrikel structuur en functie in een muismodel van longslagader Vernauwing door Transthoracale Echocardiografie

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Niet-invasieve evaluatie van cardiale afwijkingen in experimentele autoimmuun Myocarditis door Magnetic Resonance Imaging Microscopy in de muis

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Beoordeling van Cardiac morfologische en functionele veranderingen in muismodel van Transversale Aorta Vernauwing door Echocardiografie Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

ECHO cardiografische beoordeling van cardiale anatomie en functie bij volwassen ratten

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Biventriculaire beoordeling van hartfunctie en druk-volumelussen door katheterisatie met gesloten borstkas bij muizen

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...