Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Wir schätzen die Bemühungen von Leo Gnatovskiy bei der Bearbeitung des englischen Textes dieses Manuskripts. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Diese Studie wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH) der Vereinigten Staaten (1R01HL109054) an Dr. Wang unterstützt.

Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care & Use Committee der University of Michigan genehmigt. Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Zellkultur müssen BSL2 Biological Safety Cabinet unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Für die Verfahren und Praktiken im Zusammenhang mit Viren wurde die Richtlinie zur ordnungsgemäßen Entsorgung von transfizierten Zellen, Pipettenspitzen und Röhrchen befolgt, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu...

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	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. 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E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Die Bewertung der iCMs-Funktion ist für das Kardiale Reprogrammierungsfeld notwendig. In diesem Manuskript beschreibt das Protokoll einen Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J Mausstamm, der etabliert wurde, wie die ncFs, die von den neonatalen Mäusen in diesem Stamm isoliert wurden, für die Reprogrammierung auf iCMs und die Bewertung der iCMs-Funktion durch Ca2+- Fluss verwendet werden. Dies ist eine De-novo-Methode zur Bewertung der funktionellen Reifung von iCMs.
...

Myokardinfarkt (MI) ist weltweit eine schwere Erkrankung. Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) sind weltweit die häufigste Todesursache und für rund 18,6 Millionen Todesfälle im Jahr 20191 verantwortlich,2. Die Gesamtmortalität von CVDs ist im letzten halben Jahrhundert zurückgegangen. Dieser Trend wurde jedoch in einigen unterentwickelten Ländern verlangsamt oder sogar umgekehrt1, was eine wirksamere Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erfordert. Als eine der tödlichen Manifestationen von CVD macht MI etwa die Hälfte aller Todesfälle aus, die auf CVDs in den Vereinigten Staaten zurückzuführen sind2. Während der Ischämie, mit der Blockierung der Koronararterien und der begrenzten Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff, erleidet das Myokard schwere metabolische Veränderungen, beeinträchtigt die systolische Funktion von Kardiomyozyten (CMs) und führt zum CM-Tod3. Zahlreiche Ansätze in der Herz-Kreislauf-Forschung wurden erforscht, um Herzverletzungen zu reparieren und die Funktion des verletzten Herzens wiederherzustellen4. Die direkte kardiale Reprogrammierung hat sich als eine vielversprechende Strategie zur Reparatur des geschädigten Herzens und zur Wiederherstellung seiner Funktion herausgestellt5,6. Durch die Einführung von Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) können Fibroblasten in vitro und in vivo auf iCMs umprogrammiert werden, und diese iCMs können den Narbenbereich reduzieren und die Herzfunktion verbessern7,8.
Obwohl die kardiale Reprogrammierung eine vielversprechende Strategie für die MI-Behandlung ist, gibt es noch eine Reihe von Herausforderungen. Erstens sind die Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität nicht immer so hoch wie erwartet. Die MGT-Aufforderung kann nur 8,4% (cTnT+) oder 24,7% (αMHC-GFP+) der gesamten CFs erreichen, die in vitro7 auf iCMs umprogrammiert werden sollen7, oder bis zu 35% in vivo8, was ihre Anwendung einschränkt. Selbst mit mehr im System induzierten Faktoren wie Hand29 oder Akt1/PKB10 ist die Reprogrammierungseffizienz immer noch kaum zufriedenstellend, um in einem klinischen Umfeld eingesetzt zu werden. Daher sind in diesem Bereich weitere Studien erforderlich, die sich auf die Verbesserung der Reprogrammierungseffizienz konzentrieren. Zweitens sind die elektrische Integrität und die Kontraktionseigenschaften von iCMs wichtig für die effiziente Verbesserung der Herzfunktion, aber diese sind schwierig zu bewerten. Derzeit konzentrieren sich weit verbreitete Bewertungsmethoden auf diesem Gebiet, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR der Expression einiger wichtiger CMs-Gene, alle auf die Ähnlichkeit von iCMs und CMs, aber nicht direkt mit den funktionellen Eigenschaften von iCMs. Darüber hinaus haben diese Methoden relativ komplizierte Verfahren und sind zeitaufwendig. Während Reprogrammierungsstudien in der Regel ein Screening potenzieller Reprogrammierungsfaktoren beinhalten, die die Reifung von iCMs fördern11, erfordert die kardiale Reprogrammierung eine schnelle und bequeme Methode, die auf der iCMs-Funktion basiert.
CMs öffnen die spannungsgesteuerten Calciumionenkanäle auf der Zytomembran während jedes Kontraktionszyklus, was zu einem vorübergehenden Zustrom von Calciumionen (Ca2+) aus der interzellulären Flüssigkeit in das Zytoplasma führt, um an der Myofilamentkontraktion teilzunehmen. Ein solcher Ca2+-Ein- und Abflusszyklus ist das grundlegende Merkmal der Myokardkontraktion und bildet die normale Funktion von CMs12. Daher könnte eine Methode, die den Ca2+-Zustrom erkennt, eine mögliche Möglichkeit sein, die Funktion von CMs und CM-ähnlichen Zellen, einschließlich iCMs, zu messen. Darüber hinaus bietet eine solche Methode für iCMs eine weitere Möglichkeit, die Reprogrammierungseffizienz zu bewerten.
Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) wurden entwickelt und weit verbreitet verwendet, um Zellaktivitäten, insbesondere Aktionspotenziale, anzuzeigen. Im Allgemeinen bestehen GECIs aus einer Ca2 +- Bindungsdomäne wie Calmodulin und einer Fluoreszenzdomäne wie GFP, und GCaMP3 ist eine mit hoher Affinität und Fluoreszenzintensität. Die Fluoreszenzdomäne von GCaMP3 wird aktiviert, wenn die lokale Calciumkonzentration geändert wird13. In diesem Artikel wird ein Mausstamm beschrieben, der speziell einen GCaMP3-Reporter in Myh6+-Zellen exprimiert. Durch die Einführung von MGT in die isolierten NCFs von Neugeborenen dieses Stammes kann die Reprogrammierung durch Fluoreszenz überwacht werden, die erfolgreich reprogrammierte iCMs aufweisen werden. Ein solcher Mausstamm und eine solche Methode wird eine wertvolle Plattform bieten, um die kardiale Reprogrammierung zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

Die kardiale Reprogrammierung ist zu einer potenziell vielversprechenden Therapie zur Reparatur eines beschädigten Herzens geworden. Durch die Einführung mehrerer Transkriptionsfaktoren, einschließlich Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), können Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umprogrammiert werden. Diese iCMs, wenn sie in situ in einem infarktierten Herzen erzeugt werden, integrieren sich elektrisch und mechanisch in das umgebende Myokard, was zu einer Verringerung der Narbengröße und einer Verbesserung der Herzfunktion führt. Aufgrund der relativ geringen Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität der iCMs bleibt die Charakterisierung von iCMs eine Herausforderung. Die derzeit in diesem Bereich verwendeten Methoden, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR, konzentrieren sich hauptsächlich auf die kardialspezifische Gen- und Proteinexpression, nicht aber auf die funktionelle Reifung von iCMs. Ausgelöst durch Aktionspotentiale führt das Öffnen spannungsgesteuerter Calciumkanäle in Kardiomyozyten zu einem schnellen Zustrom von Calcium in die Zelle. Daher ist die Quantifizierung der Rate des Kalziumeinstroms eine vielversprechende Methode zur Bewertung der Kardiomyozytenfunktion. Hier stellt das Protokoll eine Methode zur Bewertung der iCM-Funktion durch Calcium (Ca2 +) -Fluss vor. Ein αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mausstamm wurde durch Kreuzung von Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (unten als Myh6-Cre bezeichnet) mit Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Mäuse etabliert. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs) von P0-P2-Neugeborenenmäusen wurden isoliert und in vitro kultiviert, und eine polycistronische Konstruktion von MGT wurde in NCFs eingeführt, was zu ihrer Reprogrammierung auf iCMs führte. Da nur erfolgreich reprogrammierte iCMs GCaMP3-Reporter exprimieren, kann die funktionelle Reifung von iCMs durch Ca2+- Fluss mit Fluoreszenzmikroskopie visuell beurteilt werden. Im Vergleich zu nicht reprogrammierten NCFs zeigten NCF-iCMs einen signifikanten transienten Kalziumfluss und eine spontane Kontraktion, ähnlich wie CMs. Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Etablierung von Mausstämmen, die Isolierung und Selektion neonataler Mäuseherzen, die NCF-Isolierung, die Produktion von Retroviren zur kardialen Reprogrammierung, die iCM-Induktion, die Auswertung des iCM Ca2+- Flusses unter Verwendung unserer Reporterlinie sowie die damit verbundene statistische Analyse und Datenpräsentation. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Methoden eine wertvolle Plattform bieten werden, um die funktionelle Reifung von iCMs für kardiale Reprogrammierungsstudien zu bewerten.

Der experimentelle Workflow zur Erzeugung des Mausstamms Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 und die Genstruktur der transgenen Mäuse ist in Abbildung 1 dargestellt. Während der Mausstamm etabliert ist, wurden die Herzen der Welpen isoliert und unter einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um den Genotyp zu bestätigen. Herzen mit korrektem Genotyp zeigen ca2+-Fluss synchronisiert mit schlagen, visualisiert als GCaMP3-Fluoreszenz, während in Kontrollherzen keine F...

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In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den Calcium(Ca2+)-Fluss ermöglicht.

In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden bieten eine wertvolle Plattform, um die funktionelle Reifung von ICMs für kardiale Reprogrammierungsstudien zu bewerten. Der Kalziumfluss wird ausschließlich in ICMs beobachtet und bietet eine Möglichkeit, die funktionelle Reifung des ICM zu bewerten. Dieser Mausstamm vereinfacht die Auswertungsverfahren und erhöht die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.Dieses Protokoll ist eine neue Methode zur Bewertung der funktionellen Reifung von ICMs im Bereich der kardialen Reprogrammierung. Es kann auch angewendet werden, um die Kardiomyozytendifferenzierung und die Herzfunktion zu bewerten. Beginnen Sie mit der Gewinnung von acht bis 10 Welpen, P0 bis P2 Welpen, um 10 Millionen neonatale Herzfibroblasten oder NCFs zu isolieren.Betäuben Sie die Welpen tief durch Unterkühlung. Beobachten Sie die Herzen unter dem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass das Herz mit dem gewünschten Genotyp einen Kalziumfluss aufweist, der durch GCaMP3 bei schlagendem Herzen angezeigt wird. Die anderen Genotypen zeigen keine Fluoreszenz.Nach der Isolierung der Herzen schneiden Sie sie in vier Teile, so dass sie lose verbunden sind. Waschen Sie sie mehrmals gründlich in eiskalter Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) in einer sechs Zentimeter großen Platte, um die Verschmutzung der Blutzellen in den isolierten Zellen zu begrenzen. Verdauen Sie die Herzen mit acht Millilitern warmem 0,25% Trypsin-EDTA in 37 Grad Celsius für 10 Minuten.Verwerfen Sie den Trypsin-Überstand und fügen Sie fünf Milliliter von 0,5 Milligramm pro Milliliter warmer Typ-Zwei-Kollagenase in Hanks ausgewogene Salzlösung hinzu. Die Mischung gründlich vortreiben und bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation erneut die Mischung gründlich wirbeln und das unverdaute Gewebe durch schwerkraft absetzen lassen.Sammeln Sie den Überstand in einem konischen 15-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern kaltem Fibroblastenmedium. Verdünnen Sie die Zellen mit Fibroblastenmedium so, dass die Aussaatdichte etwa bei zwei bis 2,5 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Kubikzentimeter liegt. Dann säen Sie die Zellen in Schalen oder Tellern.Die angeschlossenen Fibroblasten sollten am zweiten Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form haben. Am Tag Null säen Sie die NCFs auf die Dichte von etwa ein bis zwei mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Kubikzentimeter im Fibroblastenmedium. Ersetzen Sie am ersten Tag das Kulturmedium durch ein virushaltiges Medium für jeden Brunnen wie gewünscht.Ersetzen Sie am Tag 2, 24 Stunden nach der Virusinfektion, das virushaltige Medium durch ein normales ICM-Medium. Beurteilen Sie den Calciumionenfluss mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die GCaMP3-positiven Zellen unter dem 10X-Objektiv und stellen Sie sicher, dass spontane Zellen im Hellfeldkanal schlagen.Herzen mit dem richtigen Genotyp zeigten einen Kalziumionenfluss, der mit dem Schlagen synchronisiert war, visualisiert als GCaMP3-Fluoreszenz. Während keine Fluoreszenz in Kontrollherzen beobachtet wurde. Isolierte NCFs befestigten sich innerhalb von zwei Stunden an der Vertiefung und zeigten einen Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form.Die Calciumionenoszillation zeigte eine GCaMP3-Fluoreszenzänderung zwischen dem Maximum und dem Minimum und die Calciumionenoszillation solcher Zellen veränderte sich periodisch. Nach der Einführung von IMAP war die Anzahl der schlagenden Cluster signifikant höher als in der kontrollierten Gruppe, da die Anzahl der GCaMP3-positiven Zellen mit Calciumionenfluss für ein hohes Leistungsfeld in der mittelbehandelten IMAP-Gruppe erhöht war. NCFs sollten frisch zubereitet und nach der Isolierung gesund sein.Ein schnelles Verfahren der Herzisolierung, des Schneidens und der richtigen Verdauungszeit kann dazu beitragen, eine Verringerung der Lebensfähigkeit und des Zustands der Zellen zu vermeiden. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, funktionell ausgereifte ICMs für Forscher der kardialen Reprogrammierung zu identifizieren. Mit mehreren weiteren Auswertungsmethoden kann man ein prägnanteres Verständnis über funktional ausgereifte ICMs erlangen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Cardiac Stress Test durch Dobutamin induziert und Überwacht durch Herzkatheter in Mäuse

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Forschung

Medizin

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Mess-Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Aktivität bei Kindern

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Beurteilung der rechtsventrikulären Struktur und Funktion in Maus-Modell der Lungenarterie Verengung durch transthorakale Echokardiographie

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Nicht-invasive Beurteilung der Herzfehlbildungen in experimentellen autoimmunen Myokarditis von Magnetic Resonance Imaging Microscopy in der Maus

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Beurteilung der Herz Morphologische und funktionelle Veränderungen in Maus-Modell der Quer Aortakonstriktion durch Echokardiographie

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Echokardiographische Beurteilung der Herzanatomie und Funktion bei erwachsenen Ratten

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Biventrikuläre Beurteilung der Herzfunktion und der Druck-Volumen-Schleifen durch Closed-Thorax-Katheterisierung bei Mäusen

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...