Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

אנו מעריכים את מאמציו של ליאו גנובסקי בעריכת הטקסט האנגלי של כתב יד זה. איור 1 נוצר עם BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) של ארצות הברית (1R01HL109054) מענק לד"ר וואנג.

כל ההליכים הניסיוניים והמנהגים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. כל ההליכים הניסיוניים והשיטות הכרוכות בתרבית תאים חייבים להתבצע בקבינט הבטיחות הביולוגית BSL2 בתנאים סטריליים. עבור הנהלים והנהלים הכרוכים בווירוסים, בוצעה ההנחיה לסילוק ?...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

הערכת פונקציית iCMs נחוצה לשדה תכנות מחדש של הלב. בכתב יד זה, הפרוטוקול מתאר Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze / J זן עכברים שהוקם, כיצד להשתמש ב- NCFs המבודדים מעכברי היילוד בזן זה לתכנות מחדש ל- iCMs, והערכת פונקציית iCMs על ידי שטף Ca2 + . זוהי שיטת de novo להערכת התבגרות פונקציונלית של iCMs....

אוטם שריר הלב (MI) היא מחלה קשה ברחבי העולם. מחלות לב וכלי דם (CVDs) הן הגורם המוביל למוות ברחבי העולם ומהווה כ-18.6 מיליון מקרי מוות בשנת 20191,2. התמותה הכוללת של תקליטורי CVD ירדה במהלך חצי המאה האחרונה. עם זאת, מגמה זו הואטה או אפילו התהפכה בכמה מדינות לא מפותחות1, מה שקורא לטיפולים יעילים יותר של תקליטורי CVD. כאחד הביטויים הקטלניים של CVD, MI מהווה כמחצית מכלל מקרי המוות המיוחסים תקליטורי CVD בארצות הברית2. במהלך האיסכמיה, עם חסימת עורקים כליליים ואספקה מוגבלת של חומרים מזינים וחמצן, שריר הלב סובל משינויים מטבוליים חמורים, פוגע בתפקוד הסיסטולי של קרדיומיוציטים (CMs), ומוביל למוות CM3. גישות רבות במחקר לב וכלי דם נחקרו כדי לתקן פגיעה בלב ולשחזר את תפקוד הלב הפגום4. תכנות לב ישיר התגלה כאסטרטגיה מבטיחה אחת לתיקון הלב הפגוע ולשיקום תפקודו5,6. על ידי הצגת Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), פיברובלסטים יכולים להיות מתוכנתים מחדש iCMs במבחנה ו in vivo, ו- iCMs אלה יכולים להפחית את אזור הצלקת ולשפר את תפקוד הלב7,8.
למרות תכנות לב מחדש היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול MI, נותרו מספר אתגרים. ראשית, יעילות התכנות מחדש, הטוהר והאיכות אינם תמיד גבוהים כצפוי. תמריץ MGT יכול להשיג רק 8.4% (cTnT+) או 24.7% (αMHC-GFP+) מסך ה- CFS שיש לתכנת מחדש ל- iCMs במבחנה7, או עד 35% ב- vivo8, מה שמגביל את היישום שלו. אפילו עם גורמים נוספים המושרים במערכת, כגון Hand29 או Akt1/PKB10, יעילות התכנות מחדש עדיין בקושי משביעת רצון לשימוש בסביבה קלינית. לכן, מחקרים נוספים התמקדו בשיפור יעילות התכנות מחדש נדרשים בתחום זה. שנית, שלמות חשמלית ומאפייני התכווצות של iCMs חשובים לשיפור יעיל של תפקוד הלב, אך אלה מאתגרים להערכה. נכון לעכשיו, שיטות הערכה נפוצות בתחום, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה, ו- qPCR של כמה ביטוי גנים של CMs מפתח, מתמקדים כולם בדמיון של iCMs ו- CMs, אך אינם קשורים ישירות למאפיינים התפקודיים של iCMs. יתר על כן, שיטות אלה יש הליכים מסובכים יחסית והם גוזלים זמן רב. בעוד מחקרי תכנות מחדש בדרך כלל כרוכים הקרנה של גורמי תכנות פוטנציאליים המקדמים התבגרות iCMs11, תכנות לב מחדש קורא שיטה מהירה ונוחה המבוססת על פונקציית iCMs.
CMs לפתוח את תעלות יוני סידן מגודר מתח על cytomembrane במהלך כל מחזור התכווצות, מה שמוביל זרם חולף של יון סידן (Ca2+) מהנוזל הבין תאי כדי ציטופלסמה להשתתף התכווצות myofilament. כזה Ca2 + זרם מחזור outflux הוא התכונה הבסיסית של התכווצות שריר הלב ומהווה את הפונקציה הרגילה של CMs12. לכן, שיטה המזהה Ca2+ זרם יכול להיות דרך פוטנציאלית למדוד את הפונקציה של CMs ותאים דמויי CM, כולל iCMs. יתר על כן, עבור iCMs, שיטה כזו מספקת דרך נוספת להעריך את יעילות התכנות מחדש.
אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית (GECIs) פותחו בשימוש נרחב כדי להצביע על פעילות התא, במיוחד פוטנציאל פעולה. בדרך כלל, GECIs מורכבים מתחום מחייב Ca2+ כגון calmodulin, ותחום פלואורסצנטי כגון GFP, ו- GCaMP3 הוא תחום עם זיקה גבוהה ועוצמת פלואורסצנטיות. תחום הפלואורסצנטיות של GCaMP3 יופעל כאשר ריכוז הסידן המקומי ישתנה13. במאמר זה, זן עכבר המבטא באופן ספציפי כתב GCaMP3 בתאי Myh6 + מתואר. על ידי הצגת MGT ל- NCFs המבודדים מיילודים של זן זה, ניתן לתכנת מחדש על ידי פלואורסצנטיות, אשר iCMs מתוכנתים מחדש בהצלחה יציגו. זן ושיטה כאלה של העכבר יספקו פלטפורמה חשובה לחקור תכנות לב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

תכנות לב הפך לטיפול מבטיח פוטנציאלי לתיקון לב פגום. על ידי החדרת גורמי שעתוק מרובים, כולל Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), פיברובלסטים ניתן לתכנת מחדש לתוך cardiomyocytes המושרה (iCMs). iCMs אלה, כאשר נוצר במקום בלב אוטם, לשלב חשמלית ומכאנית עם שריר הלב שמסביב, מה שמוביל לירידה בגודל צלקת ושיפור בתפקוד הלב. בגלל היעילות, הטוהר והאיכות הנמוכים יחסית של iCMs, אפיון iCMs נותר אתגר. השיטות הנפוצות כיום בתחום זה, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה ו- qPCR, מתמקדות בעיקר בביטוי גנים וחלבון ספציפיים לב, אך לא על ההתבגרות התפקודית של iCMs. מופעל על ידי פוטנציאל פעולה, פתיחת תעלות סידן מגודר מתח cardiomyocytes מוביל זרם מהיר של סידן לתוך התא. לכן, כימות קצב זרם הסידן היא שיטה מבטיחה להעריך את תפקוד הקרדיומיוציט. כאן, הפרוטוקול מציג שיטה להערכת תפקוד iCM על ידי שטף סידן (Ca2+). זן עכבר αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 הוקם על ידי חציית Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (המכונה Myh6-Cre להלן) עם G(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (המכונה Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) עכברים. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מעכברי יילודים P0-P2 היו מבודדים ותרבותיים במבחנה, ובנייה פוליציסטרונית של MGT הוצגה ל- NCFs, מה שהוביל לתכנות מחדש שלהם ל- iCMs. מכיוון שרק iCMs המתוכנתים מחדש בהצלחה יבטאו כתב GCaMP3, ההבשלה התפקודית של iCMs יכולה להיות מוערכת חזותית על ידי שטף Ca2+ עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בהשוואה ל- NCFs שלא תוכנתו מחדש, NCF-iCMs הראו שטף סידן ארעי משמעותי והתכווצות ספונטנית, בדומה ל- CMs. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הממסד זן העכבר, בידוד ובחירה של לבבות עכברים יילודים, בידוד NCF, ייצור של רטרווירוס לתכנות מחדש של הלב, אינדוקציה iCM, הערכה של iCM Ca2 + שטף באמצעות קו הכתב שלנו, וניתוח סטטיסטי קשור ומצגת נתונים. זה צפוי כי השיטות המתוארות כאן יספק פלטפורמה חשובה כדי להעריך את ההבשלה התפקודית של iCMs עבור מחקרים תכנות לב.

זרימת העבודה הניסיונית ליצירת זן העכבר Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ומבנה הגנים של העכברים מהונדסים מוצגת באיור 1. בעוד זן העכבר נקבע, ליבם של הגורים היה מבודד ונצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לאשר את הגנוטיפ. לבבות עם גנוטיפ נכון מראים ש-Ca2+ שטף מסונכרן עם פעימות, דמי...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

אנו מתארים כאן, את הקמתו ויישום של Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J (המכונה αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) קו כתב עכבר להערכת תכנות לב. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מבודדים מזן העכבר מומרים לקרדיומיוציטים מושרה (iCMs), ומאפשרים הערכה נוחה ויעילה של יעילות תכנות מחדש והתבגרות תפקודית של iCMs באמצעות שטף סידן (Ca2+).

הערכה במבחנה של תכנות לב מחדש על ידי מדידת שטף סידן ספציפי לב עם כתב GCaMP3

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

שיטות המתוארות בפרוטוקול זה יספקו פלטפורמה חשובה להערכת ההבשלה התפקודית של ICMs למחקרי תכנות לב. שטף הסידן נצפה באופן בלעדי ב- ICMs ומספק דרך להעריך התבגרות תפקודית ICM. זן עכבר זה מפשט את הליכי ההערכה ומשפר את יכולת הרבייה של התוצאות.פרוטוקול זה הוא שיטה חדשה להערכת ההבשלה התפקודית של ICMs בשדה תכנות מחדש של הלב. זה יכול להיות מיושם גם כדי להעריך בידול קרדיומיוצייט ותפקוד הלב. התחל על ידי השגת שמונה עד 10 גורים, P0 כדי P2 גורים לבודד 10 מיליון פיברובלסטים לב יילודים, או NCFs.מרדים עמוק את הגורים על ידי היפותרמיה. שים לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות כדי להבטיח כי הלב עם הגנוטיפ הרצוי מראה שטף סידן, המצוין על ידי GCaMP3 עם פעימות הלבבות. הגנוטיפים האחרים לא יראו פלואורסצנטיות.לאחר בידוד הלבבות, לחתוך אותם לארבע חתיכות כך שהם מחוברים באופן רופף. לשטוף אותם ביסודיות מספר פעמים בקור קרח של תמיסת מלח פוספט של דולבק, או DPBS, בצלחת שישה סנטימטרים כדי להגביל את זיהום תאי הדם בתאים המבודדים. לעכל את הלבבות עם שמונה מיליליטר של חם 0.25%טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.השליכו את הלטרפסין supernatant והוסיפו חמישה מיליליטר של 0.5 מיליגרם למיליליטר סוג חם שני קולגנאז בתמיסת המלח המאוזנת של האנק. מערבולת התערובת ביסודיות ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, שוב, מערבולת את התערובת ביסודיות ולתת את הרקמה מעוכל להתיישב על ידי כוח המשיכה.לאסוף את supernatant בצינור חרוטי 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של בינוני פיברובלסט קר. לדלל את התאים עם מדיום פיברובלסט כך צפיפות הזריעה היא סביב 2 עד 2.5 פעמים 10 עד התא הרביעי לסנטימטר מעוקב. ואז לזרוע את התאים בכלים או צלחות.הפיברובלסטים המצורפים צריכים להיות בצורת אליפסה עד עגולה ביום השני לאחר זריעה. ביום אפס, זרע את NCFs לצפיפות של סביב אחד עד שניים כפול 10 עד התא הרביעי לסנטימטר מעוקב במדיום פיברובלסט. ביום הראשון להחליף את המדיום התרבותי עם וירוס המכיל מדיום עבור כל טוב רצוי.ביום 2, 24 שעות לאחר ההדבקה בנגיף, החלף את הנגיף המכיל בינוני עם בינוני ICM רגיל. להעריך את שטף יוני הסידן עם מיקרוסקופ פלואורסצנטיות הפוכה בטמפרטורת החדר. שים לב לתאים החיוביים GCaMP3 תחת המטרה 10X, להבטיח כי הוא מראה תאים ספונטניים פועמים בערוץ Brightfield.לבבות עם הגנוטיפ הנכון הראו שטף יוני סידן מסונכרן עם פעימות, הדמו כמו קמח GCaMP3. בעוד שלא נצפתה פלואורסצנטיות בלב שליטה. NCFs מבודד מחובר לבאר בתוך שעתיים והראה צורה אליפטית לעגול יום אחד לאחר זריעה.תנודות יוני הסידן הראו שינוי פלואורסצנטיות GCaMP3 בין המקסימום למינימום ותנודות יוני הסידן של תאים כאלה השתנו מעת לעת. לאחר הצגת IMAP, מספר אשכולות מכות היה גבוה משמעותית מזה בקבוצה המבוקרת כמו מספר תאים חיוביים GCaMP3 עם שטף יוני סידן עבור שדה כוח גבוה גדל בקבוצה טיפול בינוני IMAP. NCFs צריך להיות מוכן טרי ובריא לאחר הבידוד.הליך מהיר של בידוד לב, חיתוך וזמן עיכול תקין יכול לעזור למנוע ירידה הכדאיות של התא ומצב. שיטה זו מספקת דרך לזהות ICMs רווי תפקודי לחוקרי תכנות מחדש של הלב. עם שיטות הערכה נוספות מרובות, ניתן לקבל הבנה תמציתית יותר לגבי ICMs רוויים פונקציונליים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

בדיקת מאמץ לב הנגרמת על ידי Dobutamine ופיקוח על ידי צנתור בעכברים

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

מערכת מדידת פעילות לב עצבים אוטונומית (ANS) בילדים

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

הערכה של מבנה הנכון חדרית ותפקוד בעכבר הדגם של תעוקת עורק ריאה על ידי Transthoracic אקו

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

הערכה לא פולשנית של לב חריגות בניסויית אוטואימוניות דלקת שריר לב על ידי תהודה מגנטית מיקרוסקופית הדמיה בעכבר

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

אינדוקציה והערכה של איסכמיה reperfusion פגיעה בלבבות עכברוש Langendorff-perfused

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

שינויים הערכה לב מורפולוגי תפקודי עכבר דגם של מועקה הרוחבית אב עורקים על ידי הדמית אקו

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

הערכת אקו-קרדיולוגית של אנטומיה ותפקוד בחולדות למבוגרים

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

הערכה דו-חדרית של תפקוד הלב ולולאות נפח לחץ על ידי צנתור חזה סגור בעכברים

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...