Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

हम इस पांडुलिपि के अंग्रेजी पाठ के संपादन में लियो Gnatovskiy के प्रयासों की सराहना करते हैं। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था। इस अध्ययन को संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (1R01HL109054) द्वारा डॉ वांग को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

जानवरों से जुड़ी सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और प्रथाओं को मिशिगन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सेल संस्कृति से जुड़ी सभी प्रयोगात्मक प्रक्रिय?...

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	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

आईसीएम फ़ंक्शन का मूल्यांकन कार्डियक रीप्रोग्रामिंग क्षेत्र के लिए आवश्यक है। इस पांडुलिपि में, प्रोटोकॉल एक Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J माउस स्ट्रेन का वर्णन करता है जिसे स्थापित किया गया है, इस त?...

Myocardial infarction (MI) दुनिया भर में एक गंभीर बीमारी है। कार्डियोवैस्कुलर रोग (सीवीडी) दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण हैं और 20191,2 में लगभग 18.6 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदार हैं। पिछली आधी सदी के दौरान सीवीडी की कुल मृत्यु दर में कमी आई है। हालांकि, इस प्रवृत्ति को कुछ अविकसित देशों में धीमा कर दिया गया है या यहां तक कि उलट दिया गया है1, जो सीवीडी के अधिक प्रभावी उपचार के लिए कहता है। सीवीडी की घातक अभिव्यक्तियों में से एक के रूप में, एमआई संयुक्त राज्य अमेरिका में सीवीडी के लिए जिम्मेदार सभी मौतों में से लगभग आधे के लिए जिम्मेदार है। ischemia के दौरान, कोरोनरी धमनियों को अवरुद्ध करने और पोषक तत्वों और ऑक्सीजन दोनों की सीमित आपूर्ति के साथ, मायोकार्डियम गंभीर चयापचय परिवर्तनों से पीड़ित है, कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) के सिस्टोलिक कार्य को बाधित करता है, और सीएम मृत्यु 3 की ओर जाता है। हृदय की चोट की मरम्मत और घायल दिल के कार्य को बहाल करने के लिए हृदय अनुसंधान में कई दृष्टिकोणों का पता लगाया गया है4। प्रत्यक्ष कार्डियक रीप्रोग्रामिंग क्षतिग्रस्त दिल की मरम्मत और इसके कार्य को बहाल करने के लिए एक आशाजनक रणनीति के रूप में उभरा है5,6। Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) को पेश करके, फाइब्रोब्लास्ट्स को विट्रो और विवो में iCMs में फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है, और उन iCMs निशान क्षेत्र को कम कर सकते हैं और दिल के कार्य में सुधार कर सकते हैं7,8।
हालांकि कार्डियक रीप्रोग्रामिंग एमआई उपचार के लिए एक आशाजनक रणनीति है, लेकिन कई चुनौतियां बनी हुई हैं। सबसे पहले, reprogramming दक्षता, शुद्धता, और गुणवत्ता हमेशा के रूप में उम्मीद के रूप में उच्च नहीं कर रहे हैं. MGT प्रलोभन केवल 8.4% (cTnT +) या कुल CFs के 24.7% (αMHC-GFP +) को प्राप्त कर सकता है, जिसे विट्रो 7 में iCMs में पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है, या vivo8 में 35% तक, जो इसके आवेदन को सीमित करता है। यहां तक कि सिस्टम में प्रेरित अधिक कारकों के साथ, जैसे कि Hand29 या Akt1 / PKB10, reprogramming दक्षता अभी भी नैदानिक सेटिंग में उपयोग करने के लिए मुश्किल से संतोषजनक है। इस प्रकार, इस क्षेत्र में रीप्रोग्रामिंग दक्षता में सुधार पर ध्यान केंद्रित करने वाले अधिक अध्ययनों की आवश्यकता है। दूसरा, आईसीएम की विद्युत अखंडता और संकुचन विशेषताएं हृदय समारोह के कुशल सुधार के लिए महत्वपूर्ण हैं, फिर भी ये मूल्यांकन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। वर्तमान में, क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली मूल्यांकन विधियों, जिसमें फ्लो साइटोमेट्री, इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री और कुछ प्रमुख सीएम जीन अभिव्यक्ति के क्यूपीसीआर शामिल हैं, सभी आईसीएम और सीएम की समानता पर केंद्रित हैं, लेकिन सीधे आईसीएम की कार्यात्मक विशेषताओं से संबंधित नहीं हैं। इसके अलावा, उन तरीकों में अपेक्षाकृत जटिल प्रक्रियाएं हैं और समय लेने वाली हैं। जबकि reprogramming अध्ययन में आमतौर पर संभावित reprogramming कारकों की स्क्रीनिंग शामिल होती है जो iCm परिपक्वता 11 को बढ़ावा देती है, कार्डियक रीप्रोग्रामिंग iCm फ़ंक्शन के आधार पर एक त्वरित और सुविधाजनक विधि के लिए कॉल करती है।
सीएम प्रत्येक अनुबंध चक्र के दौरान साइटोमेंब्रेन पर वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम आयन चैनल खोलते हैं, जो मायोफिलामेंट संकुचन में भाग लेने के लिए इंटरसेलुलर तरल पदार्थ से साइटोप्लाज्म तक कैल्शियम आयन (Ca2+) की क्षणिक आमद की ओर जाता है। इस तरह के एक Ca2 + प्रवाह और outflux चक्र मायोकार्डियल संकुचन की मौलिक विशेषता है और CMs12 के सामान्य कार्य का गठन करता है। इस प्रकार, एक विधि जो Ca2 + प्रवाह का पता लगाती है, वह सीएम और सीएम जैसी कोशिकाओं के कार्य को मापने का एक संभावित तरीका हो सकता है, जिसमें आईसीएम भी शामिल हैं। इसके अलावा, आईसीएम के लिए, इस तरह की विधि रीप्रोग्रामिंग दक्षता का मूल्यांकन करने का एक और तरीका प्रदान करती है।
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) विकसित किए गए हैं और व्यापक रूप से सेल गतिविधियों, विशेष रूप से कार्रवाई क्षमता को इंगित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। आम तौर पर, GECIs में एक Ca2 + बाइंडिंग डोमेन होता है जैसे कि कैलमोडुलिन, और एक फ्लोरोसेंट डोमेन जैसे कि GFP, और GCaMP3 उच्च आत्मीयता और प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ एक है। GCaMP3 के प्रतिदीप्ति डोमेन सक्रिय हो जाएगा जब स्थानीय कैल्शियम एकाग्रता बदल गया है13. इस पेपर में, एक माउस स्ट्रेन जो विशेष रूप से Myh6 + कोशिकाओं में GCaMP3 रिपोर्टर को व्यक्त करता है, का वर्णन किया गया है। इस तनाव के नवजात शिशुओं से अलग-थलग NCFs के लिए MGT पेश करके, reprogramming प्रतिदीप्ति द्वारा निगरानी की जा सकती है, जो सफलतापूर्वक rerogrammed iCm प्रदर्शित करेगा। इस तरह के माउस तनाव और विधि कार्डियक रीप्रोग्रामिंग की जांच करने के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करेगी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

कार्डियक रीप्रोग्रामिंग एक क्षतिग्रस्त दिल की मरम्मत के लिए एक संभावित आशाजनक चिकित्सा बन गई है। Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) सहित कई प्रतिलेखन कारकों को पेश करके, फाइब्रोब्लास्ट्स को प्रेरित कार्डियोमायोसाइट्स (iCMs) में फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है। ये आईसीएम, जब एक इंफार्क्टेड दिल में सीटू में उत्पन्न होते हैं, तो आसपास के मायोकार्डियम के साथ विद्युत और यांत्रिक रूप से एकीकृत होते हैं, जिससे निशान के आकार में कमी आती है और हृदय समारोह में सुधार होता है। अपेक्षाकृत कम reprogramming दक्षता, शुद्धता, और iCM की गुणवत्ता के कारण, iCM का लक्षण वर्णन एक चुनौती बनी हुई है। प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री और क्यूपीसीआर सहित इस क्षेत्र में वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले तरीके, मुख्य रूप से हृदय-विशिष्ट जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित करते हैं, लेकिन आईसीएम की कार्यात्मक परिपक्वता पर नहीं। एक्शन पोटेंशियल्स द्वारा ट्रिगर किया गया, कार्डियोमायोसाइट्स में वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम चैनलों के उद्घाटन से सेल में कैल्शियम की तेजी से आमद होती है। इसलिए, कैल्शियम प्रवाह की दर को परिमाणित करना कार्डियोमायोसाइट्स फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक आशाजनक तरीका है। यहां, प्रोटोकॉल कैल्शियम (Ca2+) फ्लक्स द्वारा आईसीएम फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का परिचय देता है। एक αMHC-Cre/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 माउस स्ट्रेन को Tg (Myh6-cre)1Jmk/J (नीचे Myh6-Cre के रूप में संदर्भित) को पार करके स्थापित किया गया था, जिसमें Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze/J (जिसे नीचे Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 के रूप में संदर्भित किया गया है) चूहों के साथ। पी0-पी 2 नवजात चूहों से नवजात कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (एनसीएफ) को विट्रो में अलग और सुसंस्कृत किया गया था, और एमजीटी का एक पॉलीसिस्ट्रोनिक निर्माण एनसीएफ में पेश किया गया था, जिससे आईसीएम के लिए उनकी रीप्रोग्रामिंग हुई। क्योंकि केवल सफलतापूर्वक rerogrammed iCmS GCaMP3 रिपोर्टर व्यक्त करेंगे, iCms की कार्यात्मक परिपक्वता नेत्रहीन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Ca2 + फ्लक्स द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। Un-reprogrammed NCFs की तुलना में, NCF-iCMs ने महत्वपूर्ण कैल्शियम क्षणिक फ्लक्स और सहज संकुचन दिखाया, जो सीएम के समान है। यह प्रोटोकॉल विस्तार से माउस तनाव स्थापना, अलगाव और नवजात चूहों के दिल के चयन, एनसीएफ अलगाव, कार्डियक रीप्रोग्रामिंग के लिए रेट्रोवायरस का उत्पादन, आईसीएम प्रेरण, हमारे रिपोर्टर लाइन का उपयोग करके आईसीएम Ca2 + फ्लक्स का मूल्यांकन, और संबंधित सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा प्रस्तुति का वर्णन करता है। यह उम्मीद की जाती है कि यहां वर्णित तरीके कार्डियक रीप्रोग्रामिंग अध्ययनों के लिए आईसीएम की कार्यात्मक परिपक्वता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करेंगे।

Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 माउस स्ट्रेन और ट्रांसजेनिक चूहों की जीन संरचना उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो को चित्र 1 में दिखाया गया है। जबकि माउस स्ट्रेन स्थापित किया गया है, पिल्लों के दिल?...

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In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

हम यहां वर्णन करते हैं, एक Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 के रूप में संदर्भित) की स्थापना और आवेदन कार्डियक रीप्रोग्रामिंग मूल्यांकन के लिए माउस रिपोर्टर लाइन। माउस स्ट्रेन से अलग किए गए नवजात कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (NCFs) को प्रेरित कार्डियोमायोसाइट्स (iCMs) में परिवर्तित किया जाता है, जिससे कैल्शियम (Ca2+) फ्लक्स के माध्यम से iCms की reprogramming दक्षता और कार्यात्मक परिपक्वता के सुविधाजनक और कुशल मूल्यांकन की अनुमति मिलती है।

एक GCaMP3 रिपोर्टर के साथ कार्डियक विशिष्ट कैल्शियम फ्लक्स को मापने के द्वारा कार्डियक Reprogramming के इन विट्रो मूल्यांकन

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीके कार्डियक रीप्रोग्रामिंग अध्ययनों के लिए आईसीएम की कार्यात्मक परिपक्वता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करेंगे। कैल्शियम फ्लक्स विशेष रूप से आईसीएम में मनाया जाता है और आईसीएम कार्यात्मक परिपक्वता का मूल्यांकन करने का एक तरीका प्रदान करता है। यह माउस तनाव मूल्यांकन प्रक्रियाओं को सरल बनाता है और परिणामों की पुनरुत्पादकता को बढ़ाता है।यह प्रोटोकॉल कार्डियक रीप्रोग्रामिंग क्षेत्र में आईसीएम की कार्यात्मक परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए एक नई विधि है। इसे कार्डियोमायोसाइट्स भेदभाव और कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। आठ से 10 पिल्ले, पी 0 से पी 2 पिल्ले प्राप्त करके 10 मिलियन नवजात कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट, या एनसीएफ को अलग करने के लिए शुरू करें।हाइपोथर्मिया द्वारा पिल्लों को गहराई से एनेस्थेटिक करें। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के नीचे दिल का निरीक्षण करें कि वांछित जीनोटाइप वाला दिल कैल्शियम फ्लक्स दिखाता है, जो जीसीएएमपी 3 द्वारा दिल की धड़कन के साथ इंगित किया गया है। अन्य जीनोटाइप प्रतिदीप्ति नहीं दिखाएंगे।दिलों के अलगाव के बाद, उन्हें चार टुकड़ों में काट लें ताकि वे ढीले ढंग से जुड़े हों। अलग-थलग कोशिकाओं में रक्त कोशिका प्रदूषण को सीमित करने के लिए उन्हें बर्फ के ठंडे ड्यूलबेको के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा, या डीपीबीएस में छह सेंटीमीटर प्लेट में अच्छी तरह से धोएं। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में गर्म 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के आठ मिलीलीटर के साथ दिल को पचाएं।ट्रिप्सिन supernatant त्यागें और हांक संतुलित नमक समाधान में 0.5 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर गर्म प्रकार दो कोलेजनेस के पांच मिलीलीटर जोड़ें। मिश्रण को अच्छी तरह से घुमाएं और पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन करें। इनक्यूबेशन के बाद, फिर से, मिश्रण को अच्छी तरह से भंवर करें और निगला हुआ ऊतक गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने दें।ठंड fibroblast माध्यम के पांच milliliters के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में supernatant ले लीजिए. फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के साथ कोशिकाओं को पतला करें जैसे कि सीडिंग घनत्व दो से 2.5 गुना 10 से चौथी कोशिकाओं प्रति घन सेंटीमीटर तक होता है। फिर व्यंजनों या प्लेटों में कोशिकाओं को बीज दें।संलग्न फाइब्रोब्लास्ट्स में सीडिंग के बाद दूसरे दिन एक अंडाकार से गोल आकार होना चाहिए। दिन शून्य पर, फाइब्रोब्लास्ट माध्यम में लगभग एक से दो गुना 10 से चौथी कोशिकाओं प्रति घन सेंटीमीटर के घनत्व के लिए NCFs बीज। पहले दिन संस्कृति माध्यम को एक वायरस के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें प्रत्येक के लिए वांछित के रूप में माध्यम होता है।दूसरे दिन, वायरस संक्रमण के 24 घंटे बाद, एक नियमित आईसीएम माध्यम के साथ माध्यम वाले वायरस को बदलें। कमरे के तापमान पर एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कैल्शियम आयन फ्लक्स का आकलन करें। 10X उद्देश्य के तहत GCaMP3 सकारात्मक कोशिकाओं का निरीक्षण करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह ब्राइटफील्ड चैनल में सहज कोशिकाओं को हराता है।सही जीनोटाइप वाले दिल ों ने कैल्शियम आयन फ्लक्स को धड़कने के साथ सिंक्रनाइज़ किया, जिसे GCaMP3 फ्लोरेसेंस के रूप में देखा गया। जबकि नियंत्रण दिल में कोई प्रतिदीप्ति नहीं देखी गई थी। दो घंटे के भीतर कुएं से जुड़े अलग-थलग NCFs और सीडिंग के एक दिन बाद गोल आकार के लिए एक अंडाकार दिखाया।कैल्शियम आयन दोलन ने अधिकतम और न्यूनतम के बीच GCaMP3 प्रतिदीप्ति परिवर्तन दिखाया और ऐसी कोशिकाओं के कैल्शियम आयन दोलन समय-समय पर बदल गए। आईएमएपी को पेश करने के बाद, नियंत्रित समूह की तुलना में धड़कन समूहों की संख्या काफी अधिक थी क्योंकि एक उच्च शक्ति क्षेत्र के लिए कैल्शियम आयन फ्लक्स के साथ GCaMP3 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या आईएमएपी माध्यम उपचारित समूह में बढ़ गई थी। NCFs को अलगाव के बाद नए सिरे से तैयार और स्वस्थ होना चाहिए।हृदय अलगाव, काटने और उचित पाचन समय की एक तेज प्रक्रिया सेल व्यवहार्यता और स्थिति में कमी से बचने में मदद कर सकती है। यह विधि कार्डियक रीप्रोग्रामिंग शोधकर्ताओं के लिए कार्यात्मक परिपक्व आईसीएम की पहचान करने का एक तरीका प्रदान करती है। कई और मूल्यांकन विधियों के साथ, कोई भी कार्यात्मक परिपक्व आईसीएम के बारे में अधिक संक्षिप्त समझ प्राप्त कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

कार्डियक तनाव परीक्षण Dobutamine द्वारा प्रेरित और चूहे में कार्डियक कैथीटेराइजेशन द्वारा निगरानी

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

बच्चों में मापने कार्डिएक Autonomic तंत्रिका तंत्र (एएनएस) गतिविधि

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Transthoracic इकोकार्डियोग्राफी द्वारा पल्मोनरी धमनी कसना के माउस मॉडल में सही निलय संरचना और समारोह का आकलन

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

माउस में चुंबकीय अनुनाद माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा प्रायोगिक ऑटोइम्यून मायोकार्डिटिस में कार्डियक असामान्यताएं के noninvasive आकलन

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Langendorff-perfused चूहा दिल में प्रेरण और ischemia-reperfusion की चोट का आकलन

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

ट्रांसवर्स महाधमनी कसना के माउस मॉडल में कार्डिएक रूपात्मक के आकलन और कार्यात्मक परिवर्तन एचोकर्दिओग्रफिक इमेजिंग द्वारा

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

तैयार करना और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; चुम्बकीय की विशेषता मीर संशोधित अंतर्कलीय कोशिकाओं

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

वयस्क चूहों में कार्डियक एनाटॉमी और कार्य का इकोकार्डियोग्राफिक आकलन

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग कर कार्डियक फंक्शन का विट्रो मूल्यांकन

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

चूहों में क्लोज्ड-चेस्ट कैथीटेराइजेशन द्वारा कार्डियक फ़ंक्शन और दबाव-वॉल्यूम लूप का द्विवेंट्रिकुलर मूल्यांकन

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...