Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Apprezziamo gli sforzi di Leo Gnatovskiy nella redazione del testo inglese di questo manoscritto. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti (1R01HL109054) sovvenzione al Dr. Wang.

Tutte le procedure e le pratiche sperimentali che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care & Use Committee dell'Università del Michigan. Tutte le procedure e le pratiche sperimentali che coinvolgono la coltura cellulare devono essere eseguite BSL2 Biological Safety Cabinet in condizioni sterili. Per le procedure e le pratiche che coinvolgono i virus, è stata seguita la linea guida del corretto smaltimento delle cellule trasfettate, delle punte delle pipette e dei tubi per evitare il r...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

La valutazione della funzione degli iCM è necessaria per il campo della riprogrammazione cardiaca. In questo manoscritto, il protocollo descrive un ceppo di topo Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J che è stato stabilito, come utilizzare gli NCF isolati dai topi neonatali in questo ceppo per la riprogrammazione in iCM e la valutazione della funzione degli iCM mediante flusso di Ca2 +. Questo è un metodo de novo per valutare la maturazione funzionale degli iCM.
<p cl...

L'infarto miocardico (MI) è una malattia grave in tutto il mondo. Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo e rappresentano circa 18,6 milioni di decessi nel 20191,2. La mortalità totale delle CVD è diminuita nell'ultimo mezzo secolo. Tuttavia, questa tendenza è stata rallentata o addirittura invertita in alcuni paesi non sviluppati1, il che richiede trattamenti più efficaci delle CVD. Come una delle manifestazioni fatali di CVD, MI rappresenta circa la metà di tutti i decessi attribuiti a CVD negli Stati Uniti2. Durante l'ischemia, con il blocco delle arterie coronarie e l'apporto limitato di nutrienti e ossigeno, il miocardio subisce gravi cambiamenti metabolici, compromette la funzione sistolica dei cardiomiociti (CM) e porta alla morte del CM3. Numerosi approcci nella ricerca cardiovascolare sono stati esplorati per riparare le lesioni cardiache e ripristinare la funzione del cuore ferito4. La riprogrammazione cardiaca diretta è emersa come una strategia promettente per riparare il cuore danneggiato e ripristinarne la funzione5,6. Con l'introduzione di Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in iCM in vitro e in vivo, e questi iCM possono ridurre l'area cicatriziale e migliorare la funzione cardiaca7,8.
Sebbene la riprogrammazione cardiaca sia una strategia promettente per il trattamento dell'infarto miocardico, rimangono una serie di sfide. In primo luogo, l'efficienza, la purezza e la qualità della riprogrammazione non sono sempre così alte come previsto. L'incentivo MGT può raggiungere solo l'8,4% (cTnT+) o il 24,7% (αMHC-GFP+) del totale dei CF da riprogrammare in iCM in vitro7, o fino al 35% in vivo8, il che ne limita l'applicazione. Anche con più fattori indotti nel sistema, come Hand29 o Akt1 / PKB10, l'efficienza di riprogrammazione è ancora appena soddisfacente per essere utilizzata in un ambiente clinico. Pertanto, sono necessari ulteriori studi incentrati sul miglioramento dell'efficienza di riprogrammazione in questo campo. In secondo luogo, l'integrità elettrica e le caratteristiche di contrazione degli iCM sono importanti per il miglioramento efficiente della funzione cardiaca, ma sono difficili da valutare. Attualmente, i metodi di valutazione ampiamente utilizzati nel campo, tra cui la citometria a flusso, l'immunocitochimica e la qPCR di alcuni importanti cv di espressione dei geni, sono tutti focalizzati sulla somiglianza di iCM e CM, ma non direttamente correlati alle caratteristiche funzionali degli iCM. Inoltre, tali metodi hanno procedure relativamente complicate e richiedono molto tempo. Mentre gli studi di riprogrammazione di solito comportano uno screening dei potenziali fattori di riprogrammazione che promuovono la maturazione degli iCM11, la riprogrammazione cardiaca richiede un metodo rapido e conveniente basato sulla funzione degli iCM.
I CM aprono i canali ionici del calcio voltaggio-dipendenti sulla citomembrana durante ogni ciclo di contrazione, il che porta ad un afflusso transitorio di ioni calcio (Ca2+) dal fluido intercellulare al citoplasma per partecipare alla contrazione del miofilamento. Tale ciclo di afflusso e deflusso di Ca2+ è il tratto fondamentale della contrazione miocardica e costituisce la normale funzione delle CM12. Pertanto, un metodo che rileva l'afflusso di Ca2+ potrebbe essere un modo potenziale per misurare la funzione delle CM e delle celle simili a CM, compresi gli iCM. Inoltre, per gli iCM, tale metodo fornisce un altro modo per valutare l'efficienza della riprogrammazione.
Indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per indicare le attività cellulari, in particolare i potenziali d'azione. Generalmente, i GECI sono costituiti da un dominio di legame Ca2+ come la calmodulina e da un dominio fluorescente come GFP, e GCaMP3 è uno con alta intensità di affinità e fluorescenza. Il dominio di fluorescenza di GCaMP3 verrà attivato quando la concentrazione locale di calcio viene modificata13. In questo articolo, viene descritto un ceppo di topo che esprime specificamente un reporter GCaMP3 in cellule Myh6+. Introducendo MGT nei NCF isolati dai neonati di questo ceppo, la riprogrammazione può essere monitorata mediante fluorescenza, che esporrà con successo iCM riprogrammati. Un tale ceppo e metodo di topo fornirà una preziosa piattaforma per studiare la riprogrammazione cardiaca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

La riprogrammazione cardiaca è diventata una terapia potenzialmente promettente per riparare un cuore danneggiato. Introducendo più fattori di trascrizione, tra cui Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in cardiomiociti indotti (iCM). Questi iCM, quando generati in situ in un cuore infartuato, si integrano elettricamente e meccanicamente con il miocardio circostante, portando ad una riduzione delle dimensioni della cicatrice e ad un miglioramento della funzione cardiaca. A causa dell'efficienza, della purezza e della qualità relativamente basse della riprogrammazione degli iCM, la caratterizzazione degli iCM rimane una sfida. I metodi attualmente utilizzati in questo campo, tra cui la citometria a flusso, l'immunocitochimica e la qPCR, si concentrano principalmente sull'espressione di geni e proteine cardiaco-specifici, ma non sulla maturazione funzionale degli iCM. Innescata dai potenziali d'azione, l'apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti nei cardiomiociti porta ad un rapido afflusso di calcio nella cellula. Pertanto, quantificare il tasso di afflusso di calcio è un metodo promettente per valutare la funzione dei cardiomiociti. Qui, il protocollo introduce un metodo per valutare la funzione iCM in base al flusso di calcio (Ca2+). Un ceppo di topo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 è stato stabilito incrociando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (indicato come Myh6-Cre di seguito) con topi Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (indicato come Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito). I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) di topi neonatali P0-P2 sono stati isolati e coltivati in vitro e una costruzione policistronica di MGT è stata introdotta negli NCF, che ha portato alla loro riprogrammazione in iCM. Poiché solo gli iCM riprogrammati con successo esprimeranno il reporter GCaMP3, la maturazione funzionale degli iCM può essere valutata visivamente dal flusso Di Ca2+ con microscopia a fluorescenza. Rispetto agli NCF non riprogrammati, gli NCF-iCM hanno mostrato un flusso transitorio di calcio significativo e una contrazione spontanea, simili ai CM. Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione del ceppo murino, l'isolamento e la selezione dei cuori dei topi neonatali, l'isolamento NCF, la produzione di retrovirus per la riprogrammazione cardiaca, l'induzione iCM, la valutazione del flusso di iCM Ca2 + utilizzando la nostra linea reporter e la relativa analisi statistica e presentazione dei dati. Si prevede che i metodi qui descritti forniranno una preziosa piattaforma per valutare la maturazione funzionale degli iCM per gli studi di riprogrammazione cardiaca.

Il flusso di lavoro sperimentale per generare il ceppo di topo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e la struttura genica dei topi transgenici sono mostrati nella Figura 1. Mentre il ceppo di topo è stabilito, i cuori dei cuccioli sono stati isolati e osservati al microscopio a fluorescenza inversa per confermare il genotipo. I cuori con genotipo corretto mostrano il flusso di Ca2+ sincronizzato con il battito, visualizzato come fluorescenza GCaMP3, mentre non è stata osservat...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale degli iCM tramite il flusso di calcio (Ca2+).

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

I metodi descritti in questo protocollo forniranno una preziosa piattaforma per valutare la maturazione funzionale degli ICM per gli studi di riprogrammazione cardiaca. Il flusso di calcio è osservato esclusivamente negli ICM e fornisce un modo per valutare la maturazione funzionale dell'ICM. Questo ceppo di topo semplifica le procedure di valutazione e migliora la riproducibilità dei risultati.Questo protocollo è un nuovo metodo per valutare la maturazione funzionale degli ICM nel campo della riprogrammazione cardiaca. Può anche essere applicato per valutare la differenziazione dei cardiomiociti e la funzione cardiaca. Inizia ottenendo da otto a 10 cuccioli, da P0 a P2 per isolare 10 milioni di fibroblasti cardiaci neonatali o NCF.Anestetizzare profondamente i cuccioli per ipotermia. Osservare i cuori al microscopio a fluorescenza per assicurarsi che il cuore con il genotipo desiderato mostri il flusso di calcio, indicato da GCaMP3 con i cuori che battono. Gli altri genotipi non mostreranno fluorescenza.Dopo l'isolamento dei cuori, tagliali in quattro pezzi in modo che siano liberamente collegati. Lavali accuratamente più volte nella soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato di Dulbecco, o DPBS, in una piastra di sei centimetri per limitare l'inquinamento delle cellule del sangue nelle cellule isolate. Digerire i cuori con otto millilitri di tripsina-EDTA calda allo 0,25% a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Scartare il surnatante di tripsina e aggiungere cinque millilitri di 0,5 milligrammi per millilitro di collagenasi calda di tipo due nella soluzione salina bilanciata di Hank. Vortice la miscela accuratamente e incubata a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, di nuovo, ruotare accuratamente la miscela e lasciare che il tessuto non digerito si depositi per gravità.Raccogliere il surnatante in un tubo conico da 15 millilitri con cinque millilitri di mezzo fibroblastico freddo. Diluire le cellule con mezzo fibroblastico in modo tale che la densità di semina sia di circa due a 2,5 volte 10 alle quarte cellule per centimetro cubo. Quindi seminare le cellule in piatti o piatti.I fibroblasti attaccati dovrebbero avere una forma da ovale a rotonda il secondo giorno dopo la semina. Il giorno zero, seminare i NCF alla densità di circa una o due volte 10 alle quarte cellule per centimetro cubo nel mezzo fibroblastico. Il primo giorno sostituire il terreno di coltura con un terreno contenente virus per ogni bene desiderato.Il giorno 2, 24 ore dopo l'infezione da virus, sostituire il mezzo contenente virus con un normale mezzo ICM. Valutare il flusso di ioni calcio con un microscopio a fluorescenza invertita a temperatura ambiente. Osservare le cellule GCaMP3 positive sotto l'obiettivo 10X, assicurandosi che mostrino cellule spontanee che battono nel canale brightfield.I cuori con il genotipo corretto hanno mostrato un flusso di ioni calcio sincronizzato con il battito, visualizzato come farineria GCaMP3. Mentre nessuna fluorescenza è stata osservata nei cuori di controllo. NCF isolati attaccati al pozzo entro due ore e hanno mostrato una forma da ovale a rotonda un giorno dopo la semina.L'oscillazione degli ioni calcio ha mostrato un cambiamento di fluorescenza GCaMP3 tra il massimo e il minimo e l'oscillazione degli ioni calcio di tali cellule è cambiata periodicamente. Dopo l'introduzione dell'IMAP, il numero di cluster di battitura era significativamente superiore a quello del gruppo controllato poiché il numero di cellule GCaMP3 positive con flusso di ioni calcio per un campo ad alta potenza era aumentato nel gruppo trattato con mezzo IMAP. I NCF dovrebbero essere preparati al momento e sani dopo l'isolamento.Una rapida procedura di isolamento cardiaco, taglio e tempo di digestione corretta può aiutare a evitare la riduzione della vitalità e delle condizioni cellulari. Questo metodo fornisce un modo per identificare gli ICM maturati funzionali per i ricercatori di riprogrammazione cardiaca. Con più ulteriori metodi di valutazione, si può ottenere una comprensione più concisa degli ICM maturati funzionali.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Stress Test cardiaca indotta da dobutamina e monitorato da cateterizzazione cardiaca nei topi

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Ricerca

Medicina

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Misurazione cardiaca Sistema Nervoso Autonomo (SNA) Attività nei bambini

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Valutazione del ventricolo destro Struttura e funzione in modello murino di polmonare Arteria Costrizione da ecocardiografia transtoracica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

La valutazione non invasiva della Cardiac Anomalie in Experimental Autoimmune miocardite da Risonanza Magnetica Imaging Microscopy nel mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induzione e valutazione di ischemia-riperfusione Injury in Langendorff-perfusi Hearts Rat

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Valutazione del Cardiac morfologiche e funzionali Variazioni modello murino di trasversale aortica costrizione da parte ecocardiografica Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Valutazione ecocardiografica dell'anatomia e della funzione cardiaca nei ratti adulti

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Valutazione biventricolare della funzione cardiaca e delle anse pressione-volume mediante cateterismo a torace chiuso nei topi

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...