Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Vi setter pris på Leo Gnatovskiys innsats for å redigere den engelske teksten til dette manuskriptet. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) stipend til Dr. Wang.

Alle eksperimentelle prosedyrer og praksiser som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care &Use Committee ved University of Michigan. Alle eksperimentelle prosedyrer og praksiser som involverer cellekultur må utføres BSL2 biologisk sikkerhetsskap under sterile forhold. For prosedyrer og praksis som involverer virus, ble retningslinjen for riktig avhending av transfekterte celler, pipettespisser og rør for å unngå risiko for miljø- og helsefarer fulgt.
1. Etablering av en Tg(...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Evaluering av iCMs-funksjonen er nødvendig for hjerte-omprogrammeringsfeltet. I dette manuskriptet beskriver protokollen en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musestamme som er etablert, hvordan du bruker NCF-ene isolert fra neonatale mus i denne belastningen for omprogrammering til iCMer, og evalueringen av iCMer-funksjonen av Ca2+ flux. Dette er en de novo-metode for å evaluere iCMs funksjonelle modning.
Flere kritiske trinn er viktige for...

Hjerteinfarkt (MI) er en alvorlig sykdom over hele verden. Kardiovaskulære sykdommer (CVD) er den ledende dødsårsaken over hele verden og står for omtrent 18,6 millioner dødsfall i 20191,2. Den totale dødeligheten av CVD-er har gått ned i løpet av det siste halve århundret. Imidlertid har denne trenden blitt bremset eller til og med reversert i noen uutviklede land1, som krever mer effektive behandlinger av CVD-er. Som en av de dødelige manifestasjonene av CVD står MI for omtrent halvparten av alle dødsfall som tilskrives CVDer i USA2. Under iskemi, med blokkering av koronararterier og begrenset tilførsel av både næringsstoffer og oksygen, lider myokardiet alvorlige metabolske endringer, svekker systolisk funksjon av kardiomyocytter (CMs), og fører til CM-død3. Tallrike tilnærminger i kardiovaskulær forskning har blitt utforsket for å reparere hjerteskade og gjenopprette funksjonen til det skadede hjertet4. Direkte hjerte omprogrammering har dukket opp som en lovende strategi for å reparere det skadede hjertet og gjenopprette sin funksjon5,6. Ved å introdusere Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kan fibroblaster omprogrammeres til iCMs in vitro og in vivo, og disse iCM-ene kan redusere arrområdet og forbedre hjertefunksjonen7,8.
Selv om hjerteprogrammering er en lovende strategi for MI-behandling, er det fortsatt en rekke utfordringer. For det første er ikke alltid omprogrammeringseffektiviteten, renheten og kvaliteten så høy som forventet. MGT-induksjon kan bare oppnå 8,4 % (cTnT+) eller 24,7 % (αMHC-GFP+) av de totale CF-ene som skal omprogrammeres til iCMer in vitro7, eller opptil 35 % in vivo8, som begrenser bruken. Selv med flere faktorer indusert i systemet, for eksempel Hand29 eller Akt1/PKB10, er omprogrammeringseffektiviteten fortsatt knapt tilfredsstillende å bruke i en klinisk setting. Dermed er det behov for flere studier fokusert på å forbedre omprogrammeringseffektiviteten på dette feltet. For det andre er de elektriske integritets- og sammentrekningsegenskapene til iCMer viktige for effektiv forbedring av hjertefunksjonen, men disse er utfordrende å evaluere. For tiden er mye brukte evalueringsmetoder i feltet, inkludert strømningscytometri, immunocytokjemi og qPCR for noen viktige CMs-generuttrykk, alle fokusert på likheten til iCMer og CMs, men ikke direkte relatert til de funksjonelle egenskapene til iCMer. Videre har disse metodene relativt kompliserte prosedyrer og er tidkrevende. Mens omprogrammeringsstudier vanligvis innebærer en screening av potensielle omprogrammeringsfaktorer som fremmer iCMs modning11, krever hjerteprogrammering en rask og praktisk metode basert på iCMs-funksjon.
CMs åpner de spenningsporterte kalsiumionkanalene på cytomembranen under hver sammentrekningssyklus, noe som fører til en forbigående tilstrømning av kalsiumion (Ca2+) fra intercellulærvæsken til cytoplasma for å delta i myofilamentkontraksjonen. En slik Ca2+ tilstrømning og outflux syklus er den grunnleggende egenskapen til myokardkontraksjon og utgjør den normale funksjonen til CMs12. Dermed kan en metode som oppdager Ca2 + tilstrømning være en potensiell måte å måle funksjonen til CMs og CM-lignende celler, inkludert iCMer. Videre, for iCMer, gir en slik metode en annen måte å evaluere omprogrammeringseffektivitet på.
Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) er utviklet og mye brukt til å indikere celleaktiviteter, spesielt virkningspotensialer. Vanligvis består GECIer av et Ca2+ bindingsdomene som calmodulin, og et fluorescerende domene som GFP, og GCaMP3 er et med høy affinitet og fluorescensintensitet. Fluorescensdomenet til GCaMP3 aktiveres når den lokale kalsiumkonsentrasjonen endres13. I dette dokumentet beskrives en musestamme som spesifikt uttrykker en GCaMP3-reporter i Myh6+-celler. Ved å introdusere MGT til de isolerte NCF-ene fra nyfødte av denne stammen, kan omprogrammeringen overvåkes av fluorescens, som vellykket omprogrammerte iCMer vil vise. En slik musestamme og metode vil gi en verdifull plattform for å undersøke hjerteprogrammering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

Cardiac reprogramming har blitt en potensielt lovende terapi for å reparere et skadet hjerte. Ved å introdusere flere transkripsjonsfaktorer, inkludert Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kan fibroblaster omprogrammeres til induserte kardiomyocytter (iCMer). Disse iCM-ene, når de genereres in situ i et infarkt hjerte, integreres elektrisk og mekanisk med det omkringliggende myokardiet, noe som fører til en reduksjon i arrstørrelse og en forbedring i hjertefunksjonen. På grunn av den relativt lave omprogrammeringseffektiviteten, renheten og kvaliteten på iCM-ene, er karakterisering av iCMer fortsatt en utfordring. De for tiden brukte metodene på dette feltet, inkludert strømningscytometri, immunocytokjemi og qPCR, fokuserer hovedsakelig på hjertespesifikk gen- og proteinuttrykk, men ikke på funksjonell modning av iCMer. Utløst av virkningspotensialer fører åpningen av spenningsportede kalsiumkanaler i kardiomyocytter til en rask tilstrømning av kalsium inn i cellen. Derfor er kvantifisering av kalsiumtilstrømning en lovende metode for å evaluere kardiomyocyttfunksjon. Her introduserer protokollen en metode for å evaluere iCM-funksjonen ved kalsium (Ca2 +) flux. En αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme ble etablert ved å krysse Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referert til som Myh6-Cre nedenfor) med Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referert til som Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) mus. Neonatal hjertefibroblaster (NCFer) fra P0-P2 neonatale mus ble isolert og dyrket in vitro, og en polycistronic konstruksjon av MGT ble introdusert til NCFer, noe som førte til omprogrammering til iCMer. Fordi bare omprogrammerte iCMer vil uttrykke GCaMP3-reporter, kan den funksjonelle modningen av iCMer vurderes visuelt av Ca2 + flux med fluorescensmikroskopi. Sammenlignet med ikke-omprogrammerte NCFer viste NCF-iCMer betydelig kalsium forbigående fluks og spontan sammentrekning, lik CMs. Denne protokollen beskriver i detalj musestamme etableringen, isolasjon og utvalg av neonatal mus hjerter, NCF isolasjon, produksjon av retrovirus for hjerte omprogrammering, iCM induksjon, evaluering av iCM Ca2 + flux ved hjelp av vår reporter linje, og relatert statistisk analyse og datapresentasjon. Det forventes at metodene beskrevet her vil gi en verdifull plattform for å vurdere funksjonell modning av iCMer for hjerteprogrammeringsstudier.

Den eksperimentelle arbeidsflyten for å generere Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme og genstrukturen til de transgene musene er vist i figur 1. Mens musestammen er etablert, ble valpenes hjerter isolert og observert under et omvendt fluorescensmikroskop for å bekrefte genotypen. Hjerter med riktig genotype viser Ca2+ flux synkronisert med slag, visualisert som GCaMP3 fluorescens, mens ingen fluorescens ble observert i kontrollhjerter (figur 2<...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Vi beskriver her etableringen og anvendelsen av en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referert til som αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) musereporterlinje for hjerteprogrammeringsvurdering. Neonatal hjertefibroblaster (NCFer) isolert fra musestammen omdannes til induserte kardiomyocytter (iCMer), noe som muliggjør praktisk og effektiv evaluering av omprogrammeringseffektivitet og funksjonell modning av iCMer via kalsium (Ca2 +) flux.

In vitro Vurdering av hjerte omprogrammering ved å måle hjertespesifikk kalsiumfluks med en GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Metoder beskrevet i denne protokollen vil gi en verdifull plattform for å vurdere funksjonell modning av ICMer for hjerteprogrammeringsstudier. Kalsiumstrømmen observeres utelukkende i ICMer og gir en måte å evaluere ICM funksjonell modning på. Denne musestammen forenkler evalueringsprosedyrene og forbedrer reproduserbarheten av resultatene.Denne protokollen er en ny metode for å evaluere ICMs funksjonelle modning innen hjerteprogrammeringsfelt. Det kan også brukes til å evaluere kardiomyocyttdifferensiering og hjertefunksjon. Begynn med å skaffe åtte til ti valper, P0 til P2 valper for å isolere 10 millioner neonatal hjertefibroblaster, eller NCFer.Bedøv valpene dypt ved hypotermi. Vær oppmerksom på hjertene under fluorescensmikroskopet for å sikre at hjertet med ønsket genotype viser kalsiumfluks, indikert av GCaMP3 med hjertene som slår. De andre genotypene vil ikke vise fluorescens.Etter isolasjon av hjertene, kutt dem i fire stykker slik at de er løst forbundet. Vask dem grundig flere ganger i iskald Dulbeccos fosfatbufrede saltvann, eller DPBS, i en seks centimeter plate for å begrense blodcelleforurensningen i de isolerte cellene. Fordøye hjertene med åtte milliliter varme 0,25% Trypsin-EDTA i 37 grader Celsius i 10 minutter.Kast Trypsin-supernatanten og tilsett fem milliliter 0,5 milligram per milliliter varm type to kollagen i Hanks balanserte saltoppløsning. Virvel blandingen grundig og inkubert ved 37 grader Celsius i fem minutter. Etter inkubasjonen, igjen, virvel blandingen grundig og la det ufordøyde vevet slå seg ned av tyngdekraften.Samle supernatanten i et 15 milliliter konisk rør med fem milliliter kaldt fibroblastmedium. Fortynn cellene med fibroblastmedium slik at såddtettheten er rundt to til 2,5 ganger 10 til fjerde celler per kubikkcentimeter. Frø deretter cellene i retter eller tallerkener.De vedlagte fibroblaster skal ha en oval til rund form på den andre dagen etter sådd. På dag null frø NCF-ene til tettheten av rundt en til to ganger 10 til fjerde celler per kubikkcentimeter i fibroblastmedium. På dag én erstatter man kulturmediet med et virus som inneholder medium for hver enkelt så vel som ønsket.På dag 2, 24 timer etter virusinfeksjonen, erstatt viruset som inneholder medium med et vanlig ICM-medium. Vurder kalsiumionfluksen med et invertert fluorescensmikroskop ved romtemperatur. Følg GCaMP3 positive celler under 10X mål, og sørg for at det viser spontane celler som slår i brightfield-kanalen.Hjerter med riktig genotype viste kalsiumionfluks synkronisert med slag, visualisert som GCaMP3 flourescence. Selv om det ikke ble observert fluorescens i kontrollhjerter. Isolerte NCFer festet til brønnen innen to timer og viste en oval til rund form en dag etter sådd.Kalsiumionoscillasjonen viste GCaMP3 fluorescensendring mellom maksimum og minimum og kalsiumionoscillasjon av slike celler endret seg periodisk. Etter å ha introdusert IMAP, var antall slagklynger betydelig høyere enn i den kontrollerte gruppen, da antall GCaMP3 positive celler med kalsiumionfluks for et høyeffektsfelt ble økt i IMAP-mediumbehandlet gruppe. NCF-er bør være nytilberedt og sunne etter isolasjon.En rask prosedyre for hjerteisolasjon, kutting og riktig fordøyelsestid kan bidra til å unngå reduksjon i celle levedyktighet og tilstand. Denne metoden gir en måte å identifisere funksjonelle modne ICMer for hjerteprogrammeringsforskere. Med flere ytterligere evalueringsmetoder kan man få en mer kortfattet forståelse av funksjonelle modne ICMer.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Cardiac Stress Test indusert av Dobutamine og overvåkes av Hjertekateterisering i Mus

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Måling Cardiac autonome nervesystemet (ANS) Aktivitet hos barn

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Vurdering av Høyreventrikulært struktur og funksjon i Mouse Modell av lungearterie Innsnevring av Transtorakal Ekkokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Noninvasive Vurdering av hjertefeil i Experimental Autoimmune Myokarditt ved Magnetic Resonance Mikros Imaging i mus

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induksjon og vurdering av iskemi-reperfusjon Injury in Langendorff-perfuserte rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Vurdering av Cardiac morfologiske og funksjonelle endringer i musemodell for Tverr aortic Innsnevring av ekkokardiografi Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Fremstilling og<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av magnetisert mir-modifisert endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Echocardiographic vurdering av CARDIAC Anatomy og funksjon i voksen rotter

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering av hjertefunksjon ved hjelp av skinned kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Biventrikulær vurdering av hjertefunksjon og trykk-volum-sløyfer ved lukket brystkateterisering hos mus

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...