Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Agradecemos os esforços de Leo Gnatovskiy na edição do texto em inglês deste manuscrito. A Figura 1 foi criada com BioRender.com. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) dos Estados Unidos (1R01HL109054) para o Dr. Wang.

Todos os procedimentos e práticas experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Todos os procedimentos experimentais e práticas envolvendo a cultura celular devem ser realizados no Gabinete de Segurança Biológica BSL2 em condições estéreis. Para os procedimentos e práticas envolvendo vírus, seguiu-se a diretriz do descarte adequado de células transfeinadas, pontas de pipeta e tubos para evitar o risco de riscos ambientais e ...

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	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. 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E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. 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(105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Avaliar a função iCMs é necessário para o campo de reprogramação cardíaca. Neste manuscrito, o protocolo descreve uma cepa de camundongos Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J linhagem de camundongos que foi estabelecida, como usar os NCFs isolados dos camundongos neonatais nesta cepa para a reprogramação para iCMs, e a avaliação da função iCMs por ca2+ flux. Trata-se de um método de novo para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs.
<p class="jove_con...

O infarto do miocárdio (MI) é uma doença grave em todo o mundo. As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte no mundo e respondem por aproximadamente 18,6 milhões de mortes em 20191,2. A mortalidade total de DCV diminuiu ao longo do último meio século. No entanto, essa tendência tem sido desacelerada ou até mesmo revertida em alguns países não desenvolvidos1, o que exige tratamentos mais eficazes dos DCV. Como uma das manifestações fatais da DCV, o MI é responsável por cerca de metade de todas as mortes atribuídas aos DCV nos Estados Unidos2. Durante a isquemia, com o bloqueio das artérias coronárias e o fornecimento limitado de nutrientes e oxigênio, o miocárdio sofre alterações metabólicas graves, prejudica a função sistólica dos cardiomiócitos (CMs), e leva à morte de CM3. Inúmeras abordagens na pesquisa cardiovascular têm sido exploradas para reparar lesões cardíacas e restaurar a função do coração ferido4. A reprogramação cardíaca direta surgiu como uma estratégia promissora para reparar o coração danificado e restaurar sua função5,6. Ao introduzir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados para iCMs in vitro e in vivo, e esses iCMs podem reduzir a área da cicatriz e melhorar a função cardíaca7,8.
Embora a reprogramação cardíaca seja uma estratégia promissora para o tratamento de MI, ainda há uma série de desafios. Em primeiro lugar, a eficiência, pureza e qualidade da reprogramação nem sempre são tão altas quanto o esperado. O indução MGT só pode atingir 8,4% (cTnT+) ou 24,7% (αMHC-GFP+) do total de CFs a serem reprogramados para iCMs in vitro7, ou até 35% in vivo8, o que limita sua aplicação. Mesmo com mais fatores induzidos no sistema, como Hand29 ou Akt1/PKB10, a eficiência de reprogramação ainda é pouco satisfatória para ser usada em um ambiente clínico. Assim, mais estudos focados na melhoria da eficiência de reprogramação são necessários neste campo. Em segundo lugar, as características de integridade elétrica e contração dos ICMs são importantes para a melhoria eficiente da função cardíaca, mas estas são desafiadoras de avaliar. Atualmente, métodos de avaliação amplamente utilizados no campo, incluindo citometria de fluxo, imunocitoquímica e qPCR de algumas expressões fundamentais de genes de CMs, estão todos focados na similaridade de iCMs e CMs, mas não diretamente relacionados com as características funcionais dos ICMs. Além disso, esses métodos têm procedimentos relativamente complicados e são demorados. Enquanto os estudos de reprogramação geralmente envolvem uma triagem de potenciais fatores de reprogramação que promove a maturação do ICMs11, a reprogramação cardíaca exige um método rápido e conveniente baseado na função iCMs.
Os CMs abrem os canais de íons de cálcio fechados de tensão no citomembano durante cada ciclo de contração, o que leva a um fluxo transitório de íon de cálcio (Ca2+) do fluido intercelular ao citoplasma para participar da contração do miofilamento. Tal fluxo ca2+ e ciclo outflux é o traço fundamental da contração do miocárdio e constitui a função normal dos CMs12. Assim, um método que detecta o fluxo de Ca2+ pode ser uma maneira potencial de medir a função de CMs e células semelhantes a CM, incluindo iCMs. Além disso, para os ICMs, tal método fornece outra forma de avaliar a eficiência da reprogramação.
Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para indicar atividades celulares, especialmente potenciais de ação. Geralmente, os GECIs consistem em um domínio de ligação Ca2+ , como calmodulin, e um domínio fluorescente como o GFP, e o GCaMP3 é um com alta afinidade e intensidade de fluorescência. O domínio de fluorescência do GCaMP3 será ativado quando a concentração local de cálcio for alterada13. Neste artigo, uma cepa de rato que expressa especificamente um repórter GCaMP3 em células Myh6+ é descrita. Ao introduzir o MGT nos NCFs isolados dos recém-nascidos desta cepa, a reprogramação pode ser monitorada por fluorescência, que irá exibir com sucesso iCMs reprogramados. Tal cepa e método do rato fornecerá uma plataforma valiosa para investigar a reprogramação cardíaca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

A reprogramação cardíaca tornou-se uma terapia potencialmente promissora para reparar um coração danificado. Ao introduzir múltiplos fatores de transcrição, incluindo Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados em cardiomiócitos induzidos (iCMs). Esses iCMs, quando gerados in situ em um coração infartado, integram-se eletricamente e mecanicamente com o miocárdio circundante, levando a uma redução no tamanho da cicatriz e uma melhora na função cardíaca. Devido à eficiência, pureza e qualidade relativamente baixa da reprogramação dos iCMs, a caracterização dos ICMs continua sendo um desafio. Os métodos atualmente utilizados neste campo, incluindo citometria de fluxo, imunocytoquímica e qPCR, concentram-se principalmente na expressão genética e proteína específica do coração, mas não na maturação funcional dos ICMs. Desencadeada por potenciais de ação, a abertura de canais de cálcio fechados com tensão em cardiomiócitos leva a um rápido fluxo de cálcio na célula. Portanto, quantificar a taxa de influxo de cálcio é um método promissor para avaliar a função cardiomiócito. Aqui, o protocolo introduz um método para avaliar a função do ICMS por fluxo de cálcio (Ca2+). Uma cepa de rato αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 foi estabelecida cruzando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referido como Myh6-Cre abaixo) com gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo). Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) de camundongos neonatais P0-P2 foram isolados e cultivados in vitro, e uma construção policistrônica de MGT foi introduzida aos NCFs, o que levou à sua reprogramação para iCMs. Como somente os iCMs reprogramados com sucesso expressarão o repórter GCaMP3, a maturação funcional dos iCMs pode ser avaliada visualmente pelo fluxo Ca2+ com microscopia de fluorescência. Em comparação com os NCFs não reprogramados, os NCF-iCMs apresentaram fluxo transitório de cálcio significativo e contração espontânea, semelhante aos CMs. Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento da cepa do camundongo, isolamento e seleção de corações de camundongos neonatais, isolamento de NCF, produção de retrovírus para reprogramação cardíaca, indução de ICMS, avaliação do fluxo de ICMS Ca2+ utilizando nossa linha de repórteres, e análise estatística relacionada e apresentação de dados. Espera-se que os métodos aqui descritos forneçam uma plataforma valiosa para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca.

O fluxo de trabalho experimental para gerar a cepa de camundongos Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e a estrutura genética dos camundongos transgênicos é mostrado na Figura 1. Enquanto a cepa do camundongo é estabelecida, os corações dos filhotes foram isolados e observados sob um microscópio de fluorescência reversa para confirmar o genótipo. Corações com genótipo correto mostram fluxo Ca2+ sincronizado com batida, visualizado como fluorescência GCaMP3, enquanto...

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In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Os métodos descritos neste protocolo fornecerão uma plataforma valiosa para avaliar a maturação funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca. O fluxo de cálcio é observado exclusivamente em ICMs e fornece uma forma de avaliar a maturação funcional do ICM. Esta cepa de mouse simplifica os procedimentos de avaliação e aumenta a reprodutibilidade dos resultados.Este protocolo é um novo método para avaliar a maturação funcional dos ICMs no campo de reprogramação cardíaca. Também pode ser aplicado para avaliar a diferenciação de cardiomiócitos e a função cardíaca. Comece por obter de oito a 10 filhotes, filhotes P0 a P2 para isolar 10 milhões de fibroblastos cardíacos neonatais, ou NCFs.Anestesiar profundamente os filhotes por hipotermia. Observe os corações sob o microscópio de fluorescência para garantir que o coração com o genótipo desejado mostre fluxo de cálcio, indicado por GCaMP3 com os corações batendo. Os outros genótipos não mostrarão fluorescência.Após o isolamento dos corações, corte-os em quatro pedaços de tal forma que eles estejam vagamente conectados. Lave-os completamente várias vezes no soro fisco tamponado de Dulbecco, ou DPBS, em uma placa de seis centímetros para limitar a poluição das células sanguíneas nas células isoladas. Digerir os corações com oito mililitros de 0,25% de trypsin-EDTA em 37 graus Celsius por 10 minutos.Descarte o supernatante Trypsin e adicione cinco mililitros de 0,5 miligramas por mililitro quente tipo dois colagemnase na solução de sal balanceada de Hank. Vórtice a mistura completamente e incubada a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, novamente, vórtice da mistura completamente e deixar o tecido não digerido se acalmar pela gravidade.Colete o supernatante em um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de meio fibroblasto frio. Diluir as células com meio fibroblasto de tal forma que a densidade de semeadura esteja em torno de duas a 2,5 vezes 10 para as quatro células por centímetro cúbico. Em seguida, semeou as células em pratos ou pratos.Os fibroblastos anexados devem ter uma forma oval a redonda no segundo dia após a semeadura. No dia zero, semente os NCFs para a densidade de cerca de um a dois vezes 10 para as quatro células por centímetro cúbico em meio fibroblasto. No primeiro dia, substitua o meio de cultura por um vírus contendo meio para cada um dos desejados.No dia 2, 24 horas após a infecção pelo vírus, substitua o vírus que contém meio por um meio de ICM regular. Avalie o fluxo de íons de cálcio com um microscópio de fluorescência invertida à temperatura ambiente. Observe as células positivas GCaMP3 sob o objetivo 10X, garantindo que ela mostre células espontâneas batendo no canal brightfield.Corações com o genótipo correto mostraram fluxo de íons de cálcio sincronizado com batida, visualizado como farinha GCaMP3. Enquanto nenhuma fluorescência foi observada em corações de controle. NCFs isolados ligados ao poço dentro de duas horas e mostraram uma forma oval a redonda um dia após a semeadura.A oscilação da íon cálcio mostrou a variação da fluorescência GCaMP3 entre o máximo e o mínimo e a oscilação de íons de cálcio dessas células mudou periodicamente. Após a introdução do IMAP, o número de clusters de espancamento foi significativamente maior do que no grupo controlado, pois o número de células positivas GCaMP3 com fluxo de íons de cálcio para um campo de alta potência foi aumentado no grupo médio tratado do IMAP. Os NCFs devem ser recém-preparados e saudáveis após o isolamento.Um procedimento rápido de isolamento cardíaco, corte e tempo adequado de digestão pode ajudar a evitar a redução da viabilidade e condição celular. Este método fornece uma maneira de identificar ICMs amadurecidos funcionais para pesquisadores de reprogramação cardíaca. Com vários métodos de avaliação adicionais, pode-se obter uma compreensão mais concisa sobre ICMs funcionais maturados.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Teste de estresse cardíaco induzido por dobutamina e Monitorado por cateterismo cardíaco em ratos

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Medicina

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Medindo a atividade cardíaca Nervoso Autônomo (SNA) Sistema em Crianças

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Avaliação da Estrutura e Função do Ventrículo Direito em modelo de camundongo Pulmonary Artery constrição por Ecocardiografia transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Avaliação da morfológicas e funcionais cardíacas Mudanças no Modelo rato de Transverse aórtica constrição por ecocardiográfica de imagem

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Avaliação ecocardiográfica da anatomia e função cardíaca em ratos adultos

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Avaliação Biventricular da Função Cardíaca e Alças Pressão-Volume por Cateterismo Fechado de Tórax em Camundongos

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...