Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Мы высоко ценим усилия Льва Гнатовского в редактировании английского текста этой рукописи. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Это исследование было поддержано грантом Национального института здравоохранения (NIH) США (1R01HL109054) доктору Вану.

Все экспериментальные процедуры и практики с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Мичиганском университете. Все экспериментальные процедуры и практики, связанные с клеточной культурой, должны выполняться BSL2 Biological Safety Cabinet в ...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Оценка функции iCM необходима для поля перепрограммирования сердца. В этой рукописи протокол описывает установленный штамм мыши Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J, как использовать NCF, выделенные от неонатальных мышей в этом штамме, для перепрограммирования на iCM и оценки функции iCM по ?...

Инфаркт миокарда (ИМ) является тяжелым заболеванием во всем мире. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире и составляют около 18,6 миллиона смертей в 20191 году2. Общая смертность от ССЗ снизилась за последние полвека. Однако эта тенденция замедлилась или даже обратилась вспять в некоторых неразвитых странах1, что требует более эффективного лечения ССЗ. Как одно из смертельных проявлений ССЗ, им приходится около половины всех смертей, приписываемых ССЗ в Соединенных Штатах2. Во время ишемии, при блокировке коронарных артерий и ограниченном поступлении как питательных веществ, так и кислорода, миокард страдает от тяжелых метаболических изменений, ухудшает систолическую функцию кардиомиоцитов (КМ) и приводит к смерти ОТ СМ3. Были изучены многочисленные подходы в сердечно-сосудистых исследованиях для восстановления повреждения сердца и восстановления функции поврежденного сердца4. Прямое перепрограммирование сердца стало одной из многообещающих стратегий восстановления поврежденного сердца и восстановления его функции5,6. Вводя Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), фибробласты могут быть перепрограммированы на iCM in vitro и in vivo, и эти iCM могут уменьшить область рубца и улучшить работу сердца7,8.
Хотя перепрограммирование сердца является многообещающей стратегией для лечения ИМ, остается ряд проблем. Во-первых, эффективность перепрограммирования, чистота и качество не всегда так высоки, как ожидалось. Индуцирование MGT может достигать только 8,4% (cTnT+) или 24,7% (αMHC-GFP+) от общего количества CF, подлежащих перепрограммированию в iCM in vitro7, или до 35% in vivo8, что ограничивает его применение. Даже с большим количеством факторов, индуцированных в системе, таких как Hand29 или Akt1 / PKB10, эффективность перепрограммирования все еще едва ли удовлетворительна для использования в клинических условиях. Таким образом, в этой области необходимы дополнительные исследования, направленные на повышение эффективности перепрограммирования. Во-вторых, электрические характеристики целостности и сокращения iCM важны для эффективного улучшения функции сердца, но их сложно оценить. В настоящее время широко используемые методы оценки в этой области, включая проточную цитометрию, иммуноцитохимию и qPCR экспрессии некоторых ключевых генов CMs, сосредоточены на сходстве iCM и CM, но не связаны напрямую с функциональными характеристиками iCM. Кроме того, эти методы имеют относительно сложные процедуры и отнимают много времени. В то время как исследования перепрограммирования обычно включают скрининг потенциальных факторов перепрограммирования, которые способствуют созреванию iCM11, перепрограммирование сердца требует быстрого и удобного метода, основанного на функции iCM.
CMs открывают напряженные ионные каналы кальция на цитомембране во время каждого цикла сокращения, что приводит к переходному притоку иона кальция (Ca2+) из межклеточной жидкости в цитоплазму для участия в сокращении миофиламента. Такой цикл притока и оттока Ca2+ является фундаментальной чертой сокращения миокарда и составляет нормальную функцию CMs12. Таким образом, метод, который обнаруживает приток Ca2+ , может быть потенциальным способом измерения функции CM и CM-подобных клеток, включая iCM. Кроме того, для iCM такой метод обеспечивает еще один способ оценки эффективности перепрограммирования.
Генетически закодированные показатели кальция (GECI) были разработаны и широко используются для указания активности клеток, особенно потенциалов действия. Как правило, GECI состоят из домена связывания Ca2+ , такого как кальмодулин, и флуоресцентного домена, такого как GFP, а GCaMP3 является доменом с высокой аффинностью и интенсивностью флуоресценции. Флуоресцентный домен GCaMP3 будет активирован при изменении местной концентрации кальция13. В этой статье описан штамм мыши, который специфически экспрессирует репортер GCaMP3 в клетках Myh6+. Вводя MGT в изолированные NCF от новорожденных этого штамма, перепрограммирование можно контролировать флуоресценцией, которая будет проявляться успешно перепрограммированным iCM. Такой штамм и метод мыши обеспечат ценную платформу для исследования сердечного перепрограммирования.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

Перепрограммирование сердца стало потенциально перспективной терапией для восстановления поврежденного сердца. Путем введения нескольких факторов транскрипции, включая Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), фибробласты могут быть перепрограммированы в индуцированные кардиомиоциты (iCM). Эти iCM, генерируемые in situ в инфарктном сердце, электрически и механически интегрируются с окружающим миокардом, что приводит к уменьшению размера рубца и улучшению функции сердца. Из-за относительно низкой эффективности перепрограммирования, чистоты и качества iCM характеристика iCM остается проблемой. Используемые в настоящее время методы в этой области, включая проточную цитометрию, иммуноцитохимию и qPCR, в основном сосредоточены на сердечно-специфической экспрессии генов и белков, но не на функциональном созревании iCM. Запускаемое потенциалами действия, открытие кальциевых каналов в кардиомиоцитах приводит к быстрому притоку кальция в клетку. Поэтому количественная оценка скорости притока кальция является перспективным методом оценки функции кардиомиоцитов. Здесь протокол вводит метод оценки функции iCM по потоку кальция (Ca2+). Штамм мыши αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 был установлен путем скрещивания Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (далее именуемого Myh6-Cre) с Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (далее именуемым Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3). Неонатальные сердечные фибробласты (NCF) у неонатальных мышей P0-P2 были выделены и культивированы in vitro, а полицистронная конструкция MGT была введена в NCF, что привело к их перепрограммированию в iCM. Поскольку только успешно перепрограммированные iCM будут выражать репортер GCaMP3, функциональное созревание iCM может быть визуально оценено с помощью потока Ca2+ с помощью флуоресцентной микроскопии. По сравнению с неперепрограммированными NCF, NCF-iCM показали значительный переходный поток кальция и спонтанное сокращение, аналогичное КМ. Этот протокол подробно описывает создание штамма мыши, изоляцию и отбор сердца неонатальных мышей, изоляцию NCF, производство ретровируса для перепрограммирования сердца, индукцию iCM, оценку потока iCM Ca2 + с использованием нашей репортерной линии и соответствующий статистический анализ и представление данных. Ожидается, что методы, описанные здесь, обеспечат ценную платформу для оценки функционального созревания iCM для исследований сердечного перепрограммирования.

Экспериментальный рабочий процесс для генерации штамма мыши Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 и генной структуры трансгенных мышей показан на рисунке 1. В то время как штамм мыши установлен, сердца детенышей были изолированы и наблюдались под обратным флуоресцентным микроскопом д?...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Здесь мы описываем создание и применение линии репортеров Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (называемой αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) для оценки перепрограммирования сердца. Неонатальные сердечные фибробласты (NCF), выделенные из штамма мыши, превращаются в индуцированные кардиомиоциты (iCM), что позволяет удобно и эффективно оценивать эффективность перепрограммирования и функциональное созревание iCM через поток кальция (Ca2+).

Оценка in vitro сердечного перепрограммирования путем измерения сердечного специфического потока кальция с помощью репортера GCaMP3

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Методы, описанные в этом протоколе, обеспечат ценную платформу для оценки функционального созревания МСМ для исследований сердечного перепрограммирования. Поток кальция наблюдается исключительно в МСМ и обеспечивает способ оценки функционального созревания ICM. Этот штамм мыши упрощает процедуры оценки и повышает воспроизводимость результатов.Этот протокол является новым методом оценки функционального созревания МСМ в области перепрограммирования сердца. Он также может быть применен для оценки дифференцировки кардиомиоцитов и сердечной функции. Начните с получения от восьми до 10 детенышей, от P0 до P2, чтобы изолировать 10 миллионов неонатальных сердечных фибробластов или NCF.Глубоко обезболивают детенышей путем переохлаждения. Наблюдайте за сердцами под флуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться, что сердце с нужным генотипом показывает поток кальция, обозначенный GCaMP3 с бьющимися сердцами. Другие генотипы не будут проявлять флуоресценцию.После изоляции сердец разрежьте их на четыре части, чтобы они были слабо связаны. Тщательно промойте их несколько раз в ледяном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco, или DPBS, в шестисантиметровой пластине, чтобы ограничить загрязнение клеток крови в изолированных клетках. Переваривайте сердца восемью миллилитрами теплого 0,25%трипсина-ЭДТА в 37 градусах Цельсия в течение 10 минут.Откажитесь от супернатанта трипсина и добавьте пять миллилитров по 0,5 миллиграмма на миллилитр теплой коллагеназы второго типа в сбалансированный солевой раствор Хэнка. Тщательно вихрьте смесь и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации снова тщательно вихрьте смесь и дайте непереваренной ткани осесть под действием силы тяжести.Соберите супернатант в 15-миллилитровую коническую трубку с пятью миллилитрами холодной среды фибробластов. Разбавьте клетки средой фибробластов таким образом, чтобы плотность посева составляла от двух до 2,5 раз 10-четвертых клеток на кубический сантиметр. Затем посейте клетки в посуде или тарелках.Прикрепленные фибробласты должны иметь овальную или круглую форму на второй день после посева. На нулевой день засейте NCF до плотности примерно от одного до двух раз от 10 до четвертой клетки на кубический сантиметр в среде фибробластов. В первый день замените культуральную среду вирусосодержащей средой для каждой скважины по желанию.На 2-й день, через 24 часа после заражения вирусом, замените вируссодержащую среду обычной средой ICM. Оцените поток ионов кальция с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при комнатной температуре. Наблюдайте за положительными клетками GCaMP3 под объективом 10X, гарантируя, что он показывает спонтанные клетки, бьющиеся в канале яркого поля.Сердца с правильным генотипом показали поток ионов кальция, синхронизированный с биением, визуализированный как флуресценция GCaMP3. При этом флуоресценции в контрольных сердцах не наблюдалось. Изолированные НКФ прикреплялись к колодцу в течение двух часов и показывали овальную или круглую форму через день после посева.Колебание ионов кальция показало изменение флуоресценции GCaMP3 между максимальным и минимальным, а колебания ионов кальция таких клеток периодически менялись. После введения IMAP количество бьющихся кластеров было значительно выше, чем в контролируемой группе, поскольку количество положительных клеток GCaMP3 с потоком ионов кальция для поля высокой мощности было увеличено в группе, обработанной средой IMAP. НПФ должны быть свежеприготовленными и здоровыми после изоляции.Быстрая процедура изоляции сердца, разрезания и правильного времени пищеварения может помочь избежать снижения жизнеспособности и состояния клеток. Этот метод обеспечивает способ идентификации функциональных созревших МСМ для исследователей сердечного перепрограммирования. С помощью нескольких дополнительных методов оценки можно получить более краткое представление о функциональных созревших МСБ.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Сердечная стресс-тест индуцированный Dobutamine и контролируется катетеризации сердца у мышей

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Измерение сердечного вегетативной нервной системы (ВНС) активности у детей

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Оценка правого желудочка структуры и функции в мышиной модели легочной артерии Сужение трансторакальной эхокардиографии

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Неинвазивная оценка сердечной патологии в экспериментальном аутоиммунного миокардита при магнитно-резонансной микроскопии изображений в мышь

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Индукция и оценка ишемии-реперфузии в Лангендорфа-перфузии сердца крыс

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Оценка кардиологической Морфологические и функциональные изменения в модели мышей поперечных сужением аорты по ЭхоКГ визуализации

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

подготовки и<em&gt; In Vitro</em&gt; Характеристика замагниченного MIR-модифицированная эндотелиальные клетки

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Эхокардиографическая оценка сердечной анатомии и функции у взрослых крыс

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Оценка сердечной функции с использованием кожистого кардиомиоцита

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Бивентрикулярная оценка сердечной функции и плотно-объемных петель с помощью закрытой грудной катетеризации у мышей

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...