Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Agradecemos los esfuerzos de Leo Gnatovskiy en la edición del texto en inglés de este manuscrito. La figura 1 se creó con BioRender.com. Este estudio fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos (1R01HL109054) al Dr. Wang.

Todos los procedimientos y prácticas experimentales que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Todos los procedimientos y prácticas experimentales que impliquen cultivo celular deben realizarse en el Gabinete de Seguridad Biológica BSL2 en condiciones estériles. Para los procedimientos y prácticas que involucran virus, se siguió la directriz de la eliminación adecuada de las células transfectadas, las puntas de las pipetas y lo...

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	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. 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E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

La evaluación de la función de los iCM es necesaria para el campo de la reprogramación cardíaca. En este manuscrito, el protocolo describe una cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J cepa de ratón que se ha establecido, cómo utilizar los NCF aislados de los ratones neonatales en esta cepa para la reprogramación a iCM, y la evaluación de la función de iCM por flujo de Ca2+ . Este es un método de novo para evaluar la maduración funcional de los iCM.</p...

El infarto de miocardio (IM) es una enfermedad grave en todo el mundo. Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en todo el mundo y representan aproximadamente 18,6 millones de muertes en 20191,2. La mortalidad total de las ECV ha disminuido durante el último medio siglo. Sin embargo, esta tendencia se ha ralentizado o incluso revertido en algunos países subdesarrollados1, lo que exige tratamientos más eficaces de las ECV. Como una de las manifestaciones fatales de las ECV, el IM representa aproximadamente la mitad de todas las muertes atribuidas a las ECV en los Estados Unidos2. Durante la isquemia, con el bloqueo de las arterias coronarias y el suministro limitado de nutrientes y oxígeno, el miocardio sufre cambios metabólicos severos, deteriora la función sistólica de los cardiomiocitos (CM) y conduce a la muerte de la CM3. Se han explorado numerosos enfoques en la investigación cardiovascular para reparar la lesión cardíaca y restaurar la función del corazón lesionado4. La reprogramación cardíaca directa se ha convertido en una estrategia prometedora para reparar el corazón dañado y restaurar su función5,6. Al introducir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos pueden reprogramarse a iCM in vitro e in vivo, y esos iCM pueden reducir el área de la cicatriz y mejorar la función cardíaca7,8.
Aunque la reprogramación cardíaca es una estrategia prometedora para el tratamiento del IM, sigue habiendo una serie de desafíos. En primer lugar, la eficiencia, la pureza y la calidad de la reprogramación no siempre son tan altas como se esperaba. La inducción de MGT solo puede alcanzar el 8,4% (cTnT+) o el 24,7% (αMHC-GFP+) del total de CF que se reprogramarán a iCM in vitro7, o hasta el 35% in vivo8, lo que limita su aplicación. Incluso con más factores inducidos en el sistema, como Hand29 o Akt1 / PKB10, la eficiencia de reprogramación sigue siendo apenas satisfactoria para ser utilizada en un entorno clínico. Por lo tanto, se necesitan más estudios centrados en mejorar la eficiencia de la reprogramación en este campo. En segundo lugar, la integridad eléctrica y las características de contracción de los iCM son importantes para la mejora eficiente de la función cardíaca, sin embargo, son difíciles de evaluar. Actualmente, los métodos de evaluación ampliamente utilizados en el campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR de la expresión de algunos genes clave de CM, se centran en la similitud de los MCi y los CM, pero no están directamente relacionados con las características funcionales de los MCI. Además, esos métodos tienen procedimientos relativamente complicados y requieren mucho tiempo. Mientras que los estudios de reprogramación generalmente implican una detección de posibles factores de reprogramación que promueven la maduración de los iCM11, la reprogramación cardíaca requiere un método rápido y conveniente basado en la función de los iCM.
Los CM abren los canales iónicos de calcio dependientes de voltaje en la citomembrana durante cada ciclo de contracción, lo que conduce a una afluencia transitoria de iones de calcio (Ca2 +) desde el líquido intercelular al citoplasma para participar en la contracción del miofilamento. Tal ciclo de afluencia y salida de Ca2+ es el rasgo fundamental de la contracción miocárdica y constituye la función normal de los CM12. Por lo tanto, un método que detecte la afluencia de Ca2 + podría ser una forma potencial de medir la función de los CM y las células similares a CM, incluidos los iCM. Además, para los iCM, este método proporciona otra forma de evaluar la eficiencia de la reprogramación.
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se han desarrollado y utilizado ampliamente para indicar las actividades celulares, especialmente los potenciales de acción. En general, los GECI consisten en un dominio de unión a Ca2 + como la calmodulina, y un dominio fluorescente como GFP, y GCaMP3 es uno con alta afinidad e intensidad de fluorescencia. El dominio de fluorescencia de GCaMP3 se activará cuando se cambie la concentración local de calcio13. En este artículo, se describe una cepa de ratón que expresa específicamente un reportero GCaMP3 en células Myh6+. Al introducir MGT en los NCF aislados de neonatos de esta cepa, la reprogramación puede ser monitoreada por fluorescencia, que exhibirá iCM reprogramados con éxito. Tal tensión y método de ratón proporcionará una plataforma valiosa para investigar la reprogramación cardíaca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

La reprogramación cardíaca se ha convertido en una terapia potencialmente prometedora para reparar un corazón dañado. Al introducir múltiples factores de transcripción, incluidos Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos se pueden reprogramar en cardiomiocitos inducidos (iCM). Estos iCM, cuando se generan in situ en un corazón infartado, se integran eléctrica y mecánicamente con el miocardio circundante, lo que lleva a una reducción en el tamaño de la cicatriz y una mejora en la función cardíaca. Debido a la eficiencia, pureza y calidad de reprogramación relativamente bajas de los iCM, la caracterización de los iCM sigue siendo un desafío. Los métodos utilizados actualmente en este campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR, se centran principalmente en la expresión de genes y proteínas específicas del corazón, pero no en la maduración funcional de los iCM. Desencadenada por potenciales de acción, la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje en los cardiomiocitos conduce a una rápida afluencia de calcio en la célula. Por lo tanto, cuantificar la tasa de afluencia de calcio es un método prometedor para evaluar la función de los cardiomiocitos. Aquí, el protocolo introduce un método para evaluar la función de iCM por flujo de calcio (Ca2+). Se estableció una cepa de ratón αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 cruzando ratones Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (denominado Myh6-Cre a continuación) con ratones Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominados Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación). Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) de ratones neonatales P0-P2 se aislaron y cultivaron in vitro, y se introdujo una construcción policistrónica de MGT en los NCF, lo que llevó a su reprogramación a iCM. Debido a que solo los iCM reprogramados con éxito expresarán el reportero GCaMP3, la maduración funcional de los iCM se puede evaluar visualmente mediante flujo de Ca2 + con microscopía de fluorescencia. En comparación con los NCF no reprogramados, los NCF-iCM mostraron un flujo transitorio significativo de calcio y una contracción espontánea, similar a los CM. Este protocolo describe en detalle el establecimiento de cepas de ratones, el aislamiento y la selección de corazones de ratones neonatales, el aislamiento de NCF, la producción de retrovirus para la reprogramación cardíaca, la inducción de iCM, la evaluación del flujo de Ca2 + de iCM utilizando nuestra línea reportera, y el análisis estadístico relacionado y la presentación de datos. Se espera que los métodos descritos aquí proporcionen una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los iCM para estudios de reprogramación cardíaca.

El flujo de trabajo experimental para generar la cepa de ratón Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 y la estructura genética de los ratones transgénicos se muestra en la Figura 1. Mientras se establece la cepa de ratón, los corazones de las crías fueron aislados y observados bajo un microscopio de fluorescencia inversa para confirmar el genotipo. Los corazones con el genotipo correcto muestran un flujo de Ca2+ sincronizado con los latidos, visualizado como fluorescencia GCa...

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In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de los iCM a través del flujo de calcio (Ca2 +).

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Los métodos descritos en este protocolo proporcionarán una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los ICM para los estudios de reprogramación cardíaca. El flujo de calcio se observa exclusivamente en los ICM y proporciona una forma de evaluar la maduración funcional de la MCI. Esta cepa de ratón simplifica los procedimientos de evaluación y mejora la reproducibilidad de los resultados.Este protocolo es un nuevo método para evaluar la maduración funcional de los ICM en el campo de la reprogramación cardíaca. También se puede aplicar para evaluar la diferenciación de cardiomiocitos y la función cardíaca. Comience por obtener de ocho a 10 cachorros, cachorros P0 a P2 para aislar 10 millones de fibroblastos cardíacos neonatales, o NCF.Anestesiar profundamente a los cachorros por hipotermia. Observe los corazones bajo el microscopio de fluorescencia para asegurarse de que el corazón con el genotipo deseado muestre flujo de calcio, indicado por GCaMP3 con los corazones latiendo. Los otros genotipos no mostrarán fluorescencia.Después del aislamiento de los corazones, córtelos en cuatro pedazos para que estén vagamente conectados. Lávelos bien varias veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco helada, o DPBS, en una placa de seis centímetros para limitar la contaminación de las células sanguíneas en las células aisladas. Digiera los corazones con ocho mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA caliente en 37 grados centígrados durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante de tripsina y agregue cinco mililitros de 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa caliente tipo dos en la solución salina equilibrada de Hank. Vórtice la mezcla a fondo e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, nuevamente, vórtice la mezcla a fondo y deje que el tejido no digerido se asiente por gravedad.Recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de medio fibroblasto frío. Diluya las células con medio fibroblástico de tal manera que la densidad de siembra sea de dos a 2.5 veces 10 a la cuarta célula por centímetro cúbico. Luego siembra las células en platos o platos.Los fibroblastos unidos deben tener una forma ovalada a redonda en el segundo día después de la siembra. En el día cero, sembra los NCF a la densidad de alrededor de una a dos veces 10 a la cuarta célula por centímetro cúbico en medio de fibroblastos. En el primer día, reemplace el medio de cultivo con un medio que contenga virus para cada pozo deseado.El día 2, 24 horas después de la infección por el virus, reemplace el medio que contiene el virus con un medio ICM regular. Evalúe el flujo de iones de calcio con un microscopio de fluorescencia invertida a temperatura ambiente. Observe las células positivas GCaMP3 bajo el objetivo 10X, asegurándose de que muestra células espontáneas latiendo en el canal de campo brillante.Los corazones con el genotipo correcto mostraron flujo de iones de calcio sincronizado con el latido, visualizado como fluorescencia GCaMP3. Mientras que no se observó fluorescencia en los corazones de control. Los NCF aislados se unieron al pozo en dos horas y mostraron una forma ovalada a redonda un día después de la siembra.La oscilación de iones de calcio mostró un cambio de fluorescencia GCaMP3 entre el máximo y el mínimo y la oscilación de iones de calcio de tales células cambió periódicamente. Después de introducir IMAP, el número de grupos de latidos fue significativamente mayor que en el grupo controlado, ya que el número de células positivas GCaMP3 con flujo de iones de calcio para un campo de alta potencia aumentó en el grupo tratado con medio IMAP. Los NCF deben estar recién preparados y saludables después del aislamiento.Un procedimiento rápido de aislamiento cardíaco, corte y tiempo de digestión adecuado puede ayudar a evitar la reducción de la viabilidad y la condición celular. Este método proporciona una forma de identificar ICM madurados funcionales para los investigadores de reprogramación cardíaca. Con múltiples métodos de evaluación adicionales, se puede obtener una comprensión más concisa sobre los ICM maduros funcionales.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Prueba de esfuerzo cardíaco inducida por dobutamina y supervisado por cateterismo cardíaco en ratones

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Investigación

Medicina

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Sistema de medición de actividad nerviosa autonómica cardiaca (ANS) en los niños

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Evaluación del ventrículo derecho Estructura y función en modelo de ratón de la constricción de la arteria pulmonar mediante ecocardiografía transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Evaluación no invasiva de la cardiaca Anomalías en la miocarditis autoinmune experimental por Resonancia Magnética de imágenes de microscopía en el ratón

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Inducción y Evaluación de la isquemia-reperfusión en perfundidos Langendorff corazones de ratas

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Evaluación de la cardíaco morfológica y funcional Los cambios en el modelo de ratón de la constricción de la aorta transversa por ecocardiográfico Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Evaluación ecocardiográfica de la anatomía cardíaca y la función en ratas adultas

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Evaluación biventricular de la función cardíaca y de los asas presión-volumen mediante cateterismo torácico cerrado en ratones

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...