Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Vi uppskattar Leo Gnatovskiys ansträngningar att redigera den engelska texten i detta manuskript. Figur 1 skapades med BioRender.com. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) bidrag till Dr. Wang.

Alla försök och metoder som involverar djur godkändes av Institutional Animal Care & Use Committee vid University of Michigan. Alla experimentella förfaranden och metoder som involverar cellodling måste utföras BSL2 Biologiskt säkerhetsskåp under sterila förhållanden. För förfaranden och metoder som involverar virus följdes riktlinjen om korrekt bortskaffande av transfekterade celler, pipettspetsar och rör för att undvika risken för miljö- och hälsorisker.
1. Upprättande av en...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Utvärdering av iCMs-funktionen är nödvändig för omprogrammeringsfältet för hjärt. I detta manuskript beskriver protokollet en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musstam som har fastställts, hur man använder ncf isolerat från neonatal möss i denna stam för omprogrammering till iCMs och utvärderingen av iCMs funktion av Ca2 + flöde. Detta är en de novo-metod för att utvärdera iCMs funktionella mognad.
Flera kritiska steg är vi...

Hjärtinfarkt (MI) är en allvarlig sjukdom över hela världen. Hjärt- och kärlsjukdomar är den främsta dödsorsaken i världen och står för cirka 18,6 miljoner dödsfall 20191,2. Den totala dödligheten i cvds har minskat under det senaste halvseklet. Denna trend har dock bromsats eller till och med vänts i vissa outvecklade länder1, vilket kräver effektivare behandlingar av cvds. Som en av de dödliga manifestationerna av CVD står MI för ungefär hälften av alla dödsfall som tillskrivs CVDs i USA2. Under ischemin, med blockering av kranskärlen och begränsad tillgång på både näringsämnen och syre, lider myokardiet allvarliga metaboliska förändringar, försämrar den systoliska funktionen hos kardiomyocyter (CMs) och leder till CM-död3. Många metoder i kardiovaskulär forskning har undersökts för att reparera hjärtskada och återställa funktionen hos det skadade hjärtat4. Direkt hjärt omprogrammering har dykt upp som en lovande strategi för att reparera det skadade hjärtat och återställa dess funktion5,6. Genom att introducera Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kan fibroblaster omprogrammeras till iCMs in vitro och in vivo, och dessa iCMs kan minska ärrområdet och förbättra hjärtfunktionen7,8.
Även om hjärt omprogrammering är en lovande strategi för MI behandling, det finns fortfarande ett antal utmaningar. För det första är omprogrammeringseffektiviteten, renheten och kvaliteten inte alltid så hög som förväntat. MGT-incitament kan endast uppnå 8,4% (cTnT+) eller 24,7% (αMHC-GFP+) av de totala CFs som ska omprogrammeras till iCMs in vitro7, eller upp till 35% in vivo8, vilket begränsar dess tillämpning. Även med fler faktorer som induceras i systemet, såsom Hand29 eller Akt1/PKB10, är omprogrammeringseffektiviteten fortfarande knappt tillfredsställande att använda i en klinisk miljö. Det behövs därför fler studier som är inriktade på att förbättra omprogrammeringseffektiviteten på detta område. För det andra är iCMs elektriska integritet och sammandragningsegenskaper viktiga för en effektiv förbättring av hjärtfunktionen, men dessa är utmanande att utvärdera. För närvarande är allmänt använda utvärderingsmetoder inom området, inklusive flödescytometri, immunocytokemi och qPCR av vissa viktiga CMs gener uttryck, alla fokuserade på likheten mellan iCMs och CMs, men inte direkt relaterade till funktionella egenskaper hos iCMs. Dessutom har dessa metoder relativt komplicerade förfaranden och är tidskrävande. Medan omprogrammeringsstudier vanligtvis innebär en screening av potentiella omprogrammeringsfaktorer som främjar iCMs mognad11, kräver hjärtomprogrammering en snabb och bekväm metod baserad på iCMs-funktionen.
CMs öppnar de spänningshägnade kalciumjonkanalerna på cytomembranen under varje kontrakteringscykel, vilket leder till en övergående tillströmning av kalciumjon (Ca2+) från den intercellulära vätskan till cytoplasman för att delta i myofilamentkontraktionen. En sådan Ca2 + tillströmning och utflödescykel är det grundläggande draget för hjärtinfarkt och utgör den normala funktionen hos CMs12. Således kan en metod som upptäcker Ca2 + tillströmning vara ett potentiellt sätt att mäta funktionen hos CMs och CM-liknande celler, inklusive iCMs. För iCMs ger en sådan metod dessutom ett annat sätt att utvärdera omprogrammeringseffektiviteten.
Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs) har utvecklats och använts i stor utsträckning för att indikera cellaktiviteter, särskilt åtgärdspotentialer. I allmänhet består GECIs av en Ca2 + bindningsdomän som calmodulin, och en fluorescerande domän som GFP, och GCaMP3 är en med hög affinitet och fluorescensintensitet. Fluorescensområdet för GCaMP3 aktiveras när den lokala kalciumkoncentrationen ändras13. I detta dokument beskrivs en musstam som specifikt uttrycker en GCaMP3-reporter i Myh6 + celler. Genom att införa MGT till de isolerade NCF från nyfödda av denna stam kan omprogrammeringar övervakas av fluorescens, som framgångsrikt omprogrammerade iCMs kommer att ställa ut. En sådan musstam och metod kommer att ge en värdefull plattform för att undersöka hjärt omprogrammering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

Hjärt omprogrammering har blivit en potentiellt lovande terapi för att reparera ett skadat hjärta. Genom att införa flera transkriptionsfaktorer, inklusive Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kan fibroblaster omprogrammeras till inducerade kardiomyocyter (iCMs). Dessa iCMs, när de genereras in situ i ett infarcted hjärta, integreras elektriskt och mekaniskt med det omgivande hjärtmuskel, vilket leder till en minskning av ärrstorlek och en förbättring av hjärtfunktionen. På grund av den relativt låga omprogrammeringseffektiviteten, renheten och kvaliteten på iCMs är karakterisering av iCMs fortfarande en utmaning. De metoder som för närvarande används inom detta område, inklusive flödescytometri, immunocytokemi och qPCR, fokuserar främst på hjärtspecifik gen- och proteinuttryck men inte på funktionell mognad av iCMs. Utlöst av åtgärdspotentialer leder öppningen av spänningsdrivna kalciumkanaler i kardiomyocyter till en snabb tillströmning av kalcium till cellen. Därför är kvantifiering av kalciumtillströmningen en lovande metod för att utvärdera kardiomyocytfunktionen. Här introducerar protokollet en metod för att utvärdera iCM-funktion med kalcium (Ca2 +) flöde. En musstam av αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fastställdes genom att korsa Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (kallad Myh6-Cre nedan) med Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (kallad Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) möss nedan. Neonatal hjärt fibroblasts (NCFs) från P0-P2 neonatal möss isolerades och odlade in vitro, och en polycistronisk konstruktion av MGT introducerades till NCFs, vilket ledde till deras omprogrammering till iCMs. Eftersom endast framgångsrikt omprogrammerade iCMs kommer att uttrycka GCaMP3 reporter, kan funktionell mognad av iCMs visuellt bedömas av Ca2 + flöde med fluorescensmikroskopi. Jämfört med oprogrammerade NCFs visade NCF-iCMs betydande kalcium transienta flöde och spontan sammandragning, liknande CMs. Detta protokoll beskriver i detalj mus stam etablering, isolering och urval av neonatal möss hjärtan, NCF isolering, produktion av retrovirus för hjärt omprogrammering, iCM induktion, utvärdering av iCM Ca2 + flöde med hjälp av vår reporter linje och relaterade statistisk analys och data presentation. Det förväntas att de metoder som beskrivs här kommer att ge en värdefull plattform för att bedöma funktionell mognad av iCMs för hjärtomprogrammering studier.

Det experimentella arbetsflödet för att generera Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musstam och genstrukturen hos de transgena mössen visas i figur 1. Medan musstammen är etablerad isolerades valparnas hjärtan och observerades under ett omvänt fluorescensmikroskop för att bekräfta genotypen. Hjärtan med korrekt genotyp visar Ca2 + flux synkroniserat med stryk, visualiserat som GCaMP3 fluorescens, medan ingen fluorescens observerades i kontrollhjärtan (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Vi beskriver här etablering och tillämpning av en Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (kallas αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedan) mus reporter linje för hjärt omprogrammering bedömning. Neonatal hjärtfibblaster (NCFs) isolerade från musstammen omvandlas till inducerade kardiomyocyter (iCMs), vilket möjliggör bekväm och effektiv utvärdering av omprogrammering effektivitet och funktionell mognad av iCMs via kalcium (Ca2 +) flöde.

In vitro-bedömning av hjärt omprogrammering genom att mäta hjärtspecifikt kalciumflöde med en GCaMP3-reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Metoder som beskrivs i detta protokoll kommer att ge en värdefull plattform för att bedöma funktionell mognad av ICO för hjärt omprogrammering studier. Kalciumflödet observeras uteslutande i ICO: er och ger ett sätt att utvärdera ICM funktionell mognad. Denna musstam förenklar utvärderingsförfarandena och förbättrar resultatens reproducerbarhet.Detta protokoll är en ny metod för att utvärdera ICMs funktionella mognad i hjärt omprogrammering fält. Det kan också tillämpas för att utvärdera kardiomyocyt differentiering och hjärtfunktion. Börja med att få åtta till tio valpar, P0 till P2 valpar för att isolera 10 miljoner neonatal hjärtfibblaster, eller NCFs.Bedöva valparna genom hypotermi. Observera hjärtana under fluorescensmikroskopet för att säkerställa att hjärtat med önskad genotyp visar kalciumflöde, indikerat av GCaMP3 med hjärtan som slår. De andra genotyperna kommer inte att visa fluorescens.Efter isolering av hjärtan, skär dem i fyra bitar så att de är löst anslutna. Tvätta dem noggrant flera gånger i iskall Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning, eller DPBS, i en sex centimeterplatta för att begränsa blodcellsföroreningen i de isolerade cellerna. Smält hjärtan med åtta milliliter varm 0,25% Trypsin-EDTA i 37 grader Celsius i 10 minuter.Kassera Trypsin supernatant och tillsätt fem milliliter på 0,5 milligram per milliliter varm typ två kollagenas i Hanks balanserade saltlösning. Virvel blandningen noggrant och inkuberas vid 37 grader Celsius i fem minuter. Efter inkubationen, återigen, virvla blandningen noggrant och låt den osmälta vävnaden slå sig ner av gravitationen.Samla supernatanten i ett koniskt rör på 15 milliliter med fem milliliter kallt fibroblastmedium. Späd cellerna med fibroblastmedium så att såddtätheten är runt två till 2,5 gånger 10 till de fjärde cellerna per kubikcentimeter. Frö sedan cellerna i rätter eller tallrikar.De bifogade fibroblasterna ska ha en oval till rund form på andra dagen efter sådd. På dag noll, frö NCFs till densiteten av cirka en till två gånger 10 till de fjärde cellerna per kubikcentimeter i fibroblast medium. På dag ett ersätter kulturmediet med ett virus som innehåller medium för varje såväl som önskat.På dag 2, 24 timmar efter virusinfektionen, ersätt viruset som innehåller medium med ett vanligt ICM-medium. Utvärdera kalciumjonflödet med ett inverterat fluorescensmikroskop vid rumstemperatur. Observera de GCaMP3 positiva cellerna under 10X mål, se till att det visar spontana celler slå i brightfield kanalen.Hjärtan med rätt genotyp visade kalcium jon flux synkroniseras med stryk, visualiseras som GCaMP3 flourescence. Medan ingen fluorescens observerades i kontrollhjärtan. Isolerade NCFs fäst vid brunnen inom två timmar och visade en oval till rund form en dag efter sådd.Kalciumjon svängning visade GCaMP3 fluorescens förändring mellan maximalt och minimum och kalciumjon svängning av sådana celler ändras periodiskt. Efter införandet av IMAP var antalet slagkluster betydligt högre än i den kontrollerade gruppen eftersom antalet GCaMP3-positiva celler med kalciumjonflöde för ett högeffektfält ökade i den mediumbehandlade IMAP-gruppen. Nationella kontaktpunkter bör vara nyberedda och friska efter isolering.Ett snabbt förfarande av hjärtisolering, skärning och korrekt matsmältningstid kan bidra till att undvika minskning av cellens livskraft och tillstånd. Denna metod ger ett sätt att identifiera funktionella mognads-ICO: er för hjärtomprogrammeringsforskare. Med flera ytterligare utvärderingsmetoder kan man få en mer kortfattad förståelse för funktionella mognads-ICO: er.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Hjärt stresstest inducerad av dobutamin och övervakas av hjärtkateterisering i möss

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Mätning Hjärt autonoma nervsystemet (ANS) aktivitet hos barn

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Bedömning av höger kammare struktur och funktion i musmodell av lungartären Förträngning av Transthoracic Ekokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Noninvasive Bedömning av hjärtbiverkningar i Experimentell Autoimmun Myokardit av Magnetic Resonance Mikroskopi Imaging i musen

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion och Bedömning av ischemi-reperfusion skada i Langendorff-perfusion Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Bedömning av hjärt morfologiska och funktionella förändringar i musmodell av Tvär Aorta Förträngning av ekokardiografisk Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

framställning och<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av Magnetized miR-modifierade endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Ekokardiografisk bedömning av hjärtats anatomi och funktion hos vuxna råttor

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Bedömning av hjärtfunktion Använda Skinned Kardiomyocyter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Biventrikulär bedömning av hjärtfunktion och tryck-volymslingor genom sluten bröstkateterisering hos möss

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...