Name: in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter
Uploaded: 2022-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

Leo Gnatovskiy'nin bu makalenin İngilizce metnini düzenleme çabalarını takdir ediyoruz. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından Dr. Wang'a verilen hibe (1R01HL109054) tarafından desteklendi.

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler ve uygulamalar Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hücre kültürünü içeren tüm deneysel prosedürler ve uygulamalar steril koşullarda BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabini yapılmalıdır. Virüslerle ilgili prosedürler ve uygulamalar için, çevresel ve sağlık açısından tehlike riskini önlemek için transfected hücrelerin, pipet uçlarının ve tüplerin uygun şekilde bertaraf edilmesi kılavuzuna uyulur....

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+369+diseases+and+injuries+in+204+countries+and+territories,+1990-2019:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019.">Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).</li><li>Virani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+myocardial+infarction.">Pathophysiology of myocardial infarction.</a> Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+inhibitor+valproic+acid+protects+heart+function+through+Foxm1+pathway+after+acute+myocardial+infarction.">HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction.</a> EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+enhancement+of+in+vitro+and+in+vivo+direct+cardiac+reprogramming.">Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming.</a> Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).</li><li>Liu, L., Lei, I., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cardiac+reprogramming+for+heart+regeneration.">Improving cardiac reprogramming for heart regeneration.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mll1+H3K4+methyltransferase+activity+to+guide+cardiac+lineage+specific+reprogramming+of+fibroblasts.">Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts.</a> Cell Discovery. 2, 16036 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Generation+of+Induced+Cardiomyocytes+Using+a+Polycistronic+Construct+Expressing+Optimal+Ratio+of+Gata4,+Mef2c+and+Tbx5.">Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+specific+C-C+chemokine+signaling+pathways+enhances+cardiac+reprogramming.">Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland.">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP1-independent+signaling+involving+SERCA2b-mediated+calcium+cycling+regulates+beige+fat+thermogenesis+and+systemic+glucose+homeostasis.">UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).</li><li>Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+calcium+fluxes+in+cardiomyocytes.">Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).</li><li>Eng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 7, 10312 (2016).</li></ol>

Kardiyak yeniden programlama alanı için iCM'lerin değerlendirilmesi gereklidir. Bu yazıda, protokolde bir Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J fare suşu, iCM'lere yeniden programlama için yenidoğan farelerden izole edilen NCF'lerin bu suşta nasıl kullanılacağı ve iCM işlevinin Ca2+ fluks tarafından değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu, iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için bir de novo yöntemidir.
Bu y?...

Miyokard enfarktüsü (MI) dünya çapında ağır bir hastalıktır. Kardiyovasküler hastalıklar (CVD' ler) dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve 20191,2'de yaklaşık 18,6 milyon ölüme neden olmaktadır. CvD'lerin toplam mortalitesi son yarım yüzyıl içinde azaldı. Bununla birlikte, bu eğilim bazı gelişmemiş ülkelerde yavaşlatıldı ve hatta tersine çevrildi1, bu da CVD'lerin daha etkili tedavilerini gerektiriyor. CVD'nin ölümcül tezahürlerinden biri olarak MI, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki CVD'lere atfedilen tüm ölümlerin yaklaşık yarısını oluşturmaktadır2. İskemi sırasında, koroner arterlerin bloke edilmesi ve hem besin hem de oksijenin sınırlı tedariki ile miyokard ciddi metabolik değişikliklere uğrar, kardiyomiyositlerin (CM' ler) sistolik işlevini bozar ve CM ölümüne yol açar3. Kalp yaralanmasını onarmak ve yaralı kalbin işlevini geri kazandırmak için kardiyovasküler araştırmalarda çok sayıda yaklaşım araştırıldı4. Doğrudan kardiyak yeniden programlama, hasarlı kalbi onarmak ve işlevini geri kazandırmak için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır5,6. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) tanıtılarak fibroblastlar iCM'lere in vitro ve in vivo olarak yeniden programlanabilir ve bu iCM'ler yara bölgesini azaltabilir ve kalp fonksiyonunu iyileştirebilir7,8.
Kardiyak yeniden programlama MI tedavisi için umut verici bir strateji olsa da, bir dizi zorluk devam etmektedir. İlk olarak, yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi her zaman beklendiği kadar yüksek değildir. MGT indüksiyonu, in vitro7'deki iCM'lere yeniden programlanacak toplam CF'lerin sadece% 8.4'ünü (cTnT+) veya% 24.7'sini (αMHC-GFP +) veya uygulamasını sınırlayan% 35'e kadar in vivo8 elde edebilir. Hand29 veya Akt1/PKB10 gibi sistemde daha fazla faktör indüklenmiş olsa bile, yeniden programlama verimliliği klinik bir ortamda kullanılmak üzere hala tatmin edici değildir. Bu nedenle, bu alanda yeniden programlama verimliliğini artırmaya odaklanan daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. İkincisi, iCM'lerin elektrik bütünlüğü ve kasılma özellikleri kalp fonksiyonunun verimli bir şekilde iyileştirilmesi için önemlidir, ancak bunların değerlendirilmesi zordur. Şu anda, bazı önemli CD genlerinin ekspresyonunun akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere alanda yaygın olarak kullanılan değerlendirme yöntemleri, iCM'lerin ve CD'lerin benzerliğine odaklanmıştır, ancak iCM'lerin fonksiyonel özellikleriyle doğrudan ilişkili değildir. Ayrıca, bu yöntemler nispeten karmaşık prosedürlere sahiptir ve zaman alıcıdır. Yeniden programlama çalışmaları genellikle iCM'lerin olgunlaşmasını teşvik eden potansiyel yeniden programlama faktörlerinin taranması içerir11, kardiyak yeniden programlama iCMs işlevine dayalı hızlı ve kullanışlı bir yöntem gerektirir.
CD'ler, her büzülme döngüsü sırasında sitomembran üzerindeki voltaj kapılı kalsiyum iyon kanallarını açar ve bu da miyofilament kasılmasına katılmak için hücreler arası sıvıdan sitoplazmaya geçici bir kalsiyum iyonu (Ca2+) akınına yol açar. Böyle bir Ca2+ akını ve dış döngü miyokard kasılmasının temel özelliğidir ve CMs12'nin normal işlevini oluşturur. Bu nedenle, Ca2+ akınını algılayan bir yöntem, iCM'ler de dahil olmak üzere CD'lerin ve CM benzeri hücrelerin işlevini ölçmenin potansiyel bir yolu olabilir. Ayrıca, iCM'ler için, böyle bir yöntem yeniden programlama verimliliğini değerlendirmek için başka bir yol sağlar.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) geliştirilmiş ve başta eylem potansiyelleri olmak üzere hücre aktivitelerini belirtmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Genellikle, GECI'ler calmodulin gibi bir Ca2+ bağlama etki alanından ve GFP gibi floresan bir etki alanından oluşur ve GCaMP3 yüksek benzeşim ve floresan yoğunluğuna sahip bir etki alanıdır. GCaMP3'ün floresan etki alanı, lokal kalsiyum konsantrasyonu değiştiğinde etkinleştirilecektir13. Bu makalede, Myh6+ hücrelerinde özellikle bir GCaMP3 muhabirini ifade eden bir fare suşu açıklanmıştır. MGT'yi bu türün yenidoğanlarından izole edilmiş NCF'lere tanıtarak, yeniden programlama, başarılı bir şekilde yeniden programlanan iCM'lerin sergileyeceği floresan ile izlenebilir. Böyle bir fare zorlanması ve yöntemi, kardiyak yeniden programlamayı araştırmak için değerli bir platform sağlayacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>TP9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04&#8211;0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X800E</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>Thy1.2 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73P2F</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator and Starting Kits</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MM589</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Shaomeng Wang&#8217;s lab in University of Michigan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>Cell&#160;Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMx-puro-MGT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>111809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5413-1KG</td>
			<td>PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-209</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1143&#8211;5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-I</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST 16 Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac reprogramming by measuring cardiac specific calcium flux with a gcamp3 reporter

Kardiyak yeniden programlama, hasarlı bir kalbi onarmak için potansiyel olarak umut verici bir tedavi haline geldi. Fibroblastlar, Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) dahil olmak üzere birden fazla transkripsiyon faktörü sunarak indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) yeniden programlanabilir. Bu iCM'ler, enfarktüslü bir kalpte yerinde üretildiğinde, elektriksel ve mekanik olarak çevredeki miyokardla bütünleşir ve yara izi boyutunda bir azalmaya ve kalp fonksiyonunda iyileşmeye yol ederim. iCM'lerin nispeten düşük yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi nedeniyle, iCM'lerin karakterizasyonu bir zorluk olmaya devam etmektedir. Akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere bu alanda şu anda kullanılan yöntemler, esas olarak kardiyak gen ve protein ekspresyonine odaklanır, ancak iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasına odaklanmaz. Eylem potansiyelleri tarafından tetiklenen kardiyomiyositlerde voltaj kapılı kalsiyum kanallarının açılması hücreye hızlı bir kalsiyum akınına yol açar. Bu nedenle, kalsiyum akını oranını ölçmek kardiyomiyosit fonksiyonunu değerlendirmek için umut verici bir yöntemdir. Burada, protokol iCM işlevini kalsiyum (Ca2+) akı ile değerlendirmek için bir yöntem sunar. Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (Myh6-olarak adlandırılır) geçilerek bir αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare suşu kuruldu Aşağıdaki cre) gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıda Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fareler ile. P0-P2 yenidoğan farelerinden yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) izole edildi ve in vitro olarak kültürlendi ve NCF'lere MGT'nin polistronik bir yapısı tanıtıldı ve bu da iCM'lere yeniden programlanmalarına yol açtı. Sadece başarıyla yeniden programlanan iCM'ler GCaMP3 muhabirini ifade edeceğinden, iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşması floresan mikroskopi ile Ca2+ akı tarafından görsel olarak değerlendirilebilir. Yeniden programlanmamış NCF'lerle karşılaştırıldığında, NCF-iCM'ler CD'lere benzer şekilde önemli kalsiyum geçici akı ve spontan kasılma gösterdi. Bu protokol, fare zorlanması kuruluşu, yenidoğan fare kalplerinin izolasyonu ve seçimi, NCF izolasyonu, kardiyak yeniden programlama için retrovirüs üretimi, iCM indüksiyonu, muhabir hattımız kullanılarak iCM Ca2+ akısının değerlendirilmesi ve ilgili istatistiksel analiz ve veri sunumunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Burada açıklanan yöntemlerin kardiyak yeniden programlama çalışmaları için iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için değerli bir platform sağlaması beklanmaktadır.

Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare zorlanması ve transgenik farelerin gen yapısını oluşturmak için deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare zorlanması kurulurken, yavruların kalpleri izole edildi ve genotipi doğrulamak için ters floresan mikroskop altında gözlemlendi. Doğru genotipli kalpler Ca2+ akıyı atmakla senkronize eder, GCaMP3 floresan olarak görselleştirilirken, kontrol kalplerinde floresan gözlenmedi (Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter at JoVE.com

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Bu protokolde açıklanan yöntemler, kardiyak yeniden programlama çalışmaları için ICM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için değerli bir platform sağlayacaktır. Kalsiyum akısı sadece ICM'lerde görülür ve ICM fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmenin bir yolunu sağlar. Bu fare zorlanması değerlendirme prosedürlerini basitleştirir ve sonuçların tekrarlanabilirliğini artırır.Bu protokol, kardiyak yeniden programlama alanında ICM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için yeni bir yöntemdir. Kardiyomiyosit farklılaşması ve kardiyak fonksiyonu değerlendirmek için de uygulanabilir. 10 milyon yenidoğan kardiyak fibroblast veya NCF'yi izole etmek için sekiz ila 10 yavru, P0 ila P2 yavruları elde ederek başlayın.Yavruları hipotermi ile derinlemesine uyuşturun. İstenilen genotipe sahip kalbin, GCaMP3 tarafından kalplerin atışını göstererek kalsiyum akı gösterdiğiden emin olmak için floresan mikroskop altındaki kalpleri gözlemleyin. Diğer genotipler floresan göstermez.Kalpleri izole ettikten sonra, gevşek bir şekilde bağlı olacak şekilde dört parçaya bölün. İzole hücrelerdeki kan hücresi kirliliğini sınırlamak için buz gibi Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde veya DPBS'de altı santimetrelik bir plakada birkaç kez iyice yıkayın. 37 santigrat derecede sekiz mililitre sıcak %0,25 Trypsin-EDTA ile kalpleri 10 dakika boyunca sindirin.Trypsin süpernatantı atın ve Hank'in dengeli tuz çözeltisinde mililitre başına 0,5 miligram sıcak tip iki kollajenaz ekleyin. Karışımı iyice girdaplayın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etti. Kuluçkadan sonra, tekrar, karışımı iyice girdaplayın ve sindirilmemiş dokunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.Süpernatantı beş mililitre soğuk fibroblast ortamına sahip 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri fibroblast ortamı ile seyreltin, böyle şekilde tohumlama yoğunluğu santimetreküp başına iki ila 2,5 çarpı 10 ila dördüncü hücreler civarındadır. Daha sonra hücreleri tabaklara veya tabaklara tohumlayın.Ekli fibroblastlar, tohumlamadan sonraki ikinci günde ovalden yuvarlak şekle sahip olmalıdır. Sıfır gününde, NCF'leri fibroblast ortamında santimetreküp başına yaklaşık bir ila iki kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğuna tohumlayın. İlk gün, kültür ortamını her biri için istenen kadar orta içeren bir virüsle değiştirin.2. günde, virüs enfeksiyonundan 24 saat sonra, orta içeren virüsü normal bir ICM ortamı ile değiştirin. Kalsiyum iyon akısını oda sıcaklığında ters floresan mikroskopla değerlendirin. GCaMP3 pozitif hücrelerini 10X hedefi altında gözlemleyin, parlak alan kanalında spontan hücrelerin attığını gösterdiğindan emin olmak.Doğru genotipe sahip kalpler, GCaMP3 unescence olarak görselleştirilen, atım ile senkronize kalsiyum iyon akısı gösterdi. Kontrol kalplerinde floresan gözlenmedi. İki saat içinde kuyuya bağlı izole NCF'ler ve tohumlamadan bir gün sonra ovalden yuvarlak şekle kadar gösterdi.Kalsiyum iyon salınımı GCaMP3 floresan değişiminin maksimum ve minimum arasında değiştiğini ve bu hücrelerin kalsiyum iyon salınımının periyodik olarak değiştiğini göstermiştir. IMAP'i tanıttıktan sonra, imap orta tedavi grubunda yüksek güç alanı için kalsiyum iyon akısı olan GCaMP3 pozitif hücrelerinin sayısı artırıldığı için, dayayan kümelerin sayısı kontrollü gruptakinden önemli ölçüde daha yüksekti. NCF'ler izolasyondan sonra taze hazırlanmalı ve sağlıklı olmalıdır.Hızlı bir kalp izolasyonu, kesme ve uygun sindirim süresi prosedürü, hücre canlılığı ve durumunda azalmayı önlemeye yardımcı olabilir. Bu yöntem, kardiyak yeniden programlama araştırmacıları için fonksiyonel olgunlaşmalı ICM'leri tanımlamanın bir yolunu sağlar. Birden fazla değerlendirme yöntemiyle, fonksiyonel olgunlaşmış ICM'ler hakkında daha kısa bir anlayış elde edilebilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Kardiyak Stres Testi Dobutamin İndüklemiş ve Farelerde Kalp Kateterizasyonu tarafından İzlenen

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children

Measuring Cardiac Autonomic Nervous System ANS Activity in Children

Çocuklarda Ölçme Kardiyak Otonom Sinir Sistemi (ANS) Faaliyet

The autonomic nervous system (ANS) controls mainly automatic bodily functions that are engaged in homeostasis, like heart rate, digestion, respiratory ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Transtorasik Ekokardiyografi ile Pulmoner Arter Konstrüksiyon Fare Modeli sağ ventrikül yapı ve fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Fare Manyetik Rezonans Görüntüleme Mikroskopi tarafından Deneysel Otoimmün Miyokardit Kardiyak anormallikler noninvaziv değerlendirilmesi

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Langendorff-perfüze sıçan Hearts indüksiyon ve İskemi-reperfüzyon Hasarı Değerlendirilmesi

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Ekokardiyografik Imaging tarafından Enine Aort Konstrüksiyon Mouse Modeli Kardiyak Morfolojik Değerlendirilmesi ve Fonksiyonel Değişiklikler

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Erişkin Sıçanlarda Kardiyak Anatomi ve Fonksiyonun Ekokardiyografik Değerlendirilmesi

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Farelerde Kapalı Göğüs Kateterizasyonu ile Kardiyak Fonksiyon ve Basınç-Hacim Döngülerinin Biventriküler Değerlendirmesi

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...