Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

De auteurs willen de heer Cagney Gentry bedanken voor zijn audiovisuele ondersteuning bij het filmen van de procedure. We willen ook het Hefner VA medisch centrum erkennen voor academische ondersteuning bij het nastreven van dit project.

Alle procedures werden uitgevoerd op wake forest school of medicine Clarkson Campus voor dierstudies. Het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) werd geraadpleegd voor ethische overwegingen en details van de procedures werden ter beoordeling voorgelegd. Wake Forest IACUC keurde ons onderzoeksprotocol goed en alle procedures werden uitgevoerd onder het door IACUC goedgekeurde protocol #A17-147.
1. Voorbereiding van het infuusapparaat
<ol><li>Knip maat 10 Polyethyleen Buis (PET10)...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Hier beschrijven we een protocol van retrograde infusie in de parotisklier via het kanaal van Stensen. De beschreven methodologie biedt richtlijnen die mogelijk kunnen worden gebruikt door onderzoekers die het nut van speekselweefsel onderzoeken als een site voor gentherapie en andere toepassingen.
Er zijn meerdere kritieke stappen om het succes van de procedure te garanderen. Eerst en vooral moeten alle procedurele stappen voorzichtig worden voltooid. Krachtige versteviging van de mond kan le...

Hoewel speekselklieren bekend staan om hun exocriene productie van speeksel, hebben onderzoekers al lang hun vermogen erkend om eiwitten rechtstreeks in de bloedbaan af tescheiden 1, waardoor ze een potentieel doelwit zijn voor gentherapie voor systemische toediening, zoals vervangingshormonen of antilichaamproductie. In feite bieden speekselklieren verschillende voordelen ten opzichte van andere weefseldoelen, zoals het inherente vermogen om eiwitten te produceren voor secretie (een eigenschap die spieren missen), zware inkapseling die vectordiffusie kan beperken en goed gedifferentieerd weefsel dat stabiliteit biedt voor niet-integrerende vectoren. Bovendien zijn speekselklieren in het geval van een ernstige bijwerking niet kritiek voor het leven en kunnen ze operatief worden verwijderd. Hoewel niet onmiddellijk intuïtief, zijn parotisklieren ook gemakkelijk toegankelijk vanuit de mond via hun belangrijkste uitscheidingskanaal, Stensen's Duct2.
Gezien de voordelen van speekselweefsel voor gentherapie, is er steeds meer interesse in het verkennen van dit weefseldoel. Talrijke studies zijn al uitgevoerd in knaagdier-, honden- en niet-menselijke primatenmodellen en ten minste één klinische proef bij mensen is aan de gang3,4,5. Om het nut van dit weefseldoel voor gentherapiedoeleinden verder te onderzoeken en te ontwikkelen, zullen meer niet-menselijke primatenstudies moeten worden uitgevoerd. Dit artikel beschrijft een methode voor toegang tot de parotisklieren via Stensen's Duct om een vectored gen voor transductie af te leveren in het niet-menselijke primaatmodel. Om de afgifte van het infundaat en de anatomie van het kanaal bij het binnenkomen van de klier zichtbaar aan te tonen, werd fluoroscopie met behulp van radiocontrast uitgevoerd. Om succesvolle transductie van een vector aan te tonen, werd een Adenovirus serotype 5 (Ad5) vectored egfp-gen gebruikt. Ad5 is een goed beschreven vector die speekselweefsel kan transduceren. Hoewel het te immunogeen is voor ultiem klinisch gebruik, werd voor deze demonstratiestudie een Ad5-vector gekozen om efficiënte transductie te garanderen. Het evalueren van Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) productie is een goed beschreven methode om succesvolle transcriptie en translatie van een vectored gen na transductie aan te tonen en werd hier gedaan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

Speekselklieren zijn een aantrekkelijk weefseldoel voor gentherapie met veelbelovende resultaten die al leiden tot menselijke proeven. Ze zijn inherent in staat om eiwitten in de bloedbaan af te scheiden en zijn gemakkelijk toegankelijk, waardoor ze potentieel superieure weefselplaatsen zijn voor vervangingshormoonproductie of vaccinatie door genoverdracht. Voorgestelde methoden voor genafgifte omvatten transcutane injectie en retrograde infusie via speekselkanalen. We demonstreren hoe retrograde speekselklierinfusie (RSGI) moet worden uitgevoerd bij niet-menselijke primaten. We beschrijven de belangrijke anatomische oriëntatiepunten, waaronder de identificatie van de parotis papilla, een atraumatische methode voor het cannuleren en afdichten van Stensen's Duct met behulp van elementaire tandheelkundige hulpmiddelen, polyethyleenbuizen en cyanoacrylaat, en de juiste infusiesnelheid. Hoewel dit de minst traumatische methode van levering is, wordt de methode nog steeds beperkt door het volume dat kan worden afgeleverd (<0,5 ml) en het potentieel voor trauma aan het kanaal en de klier. We tonen met behulp van fluoroscopie aan dat een infundaat volledig in de klier kan worden afgeleverd en tonen verder aan door immunohistochemie de transductie van een typische vector en expressie van het afgeleverde gen.

Succesvolle procedure, transductie en transcriptie Figuur 1 toont de parotis papilla grenzend aan de2e kies op de achterste superieure wang. De afbeelding toont ook de juiste plaatsing van de mondbeugel, een rubberen uiteinde op het harde gehemelte en het andere rubberen uiteinde op de ipsilaterale hond. Figuur 2 toont een afbeelding genomen na succesvolle cannulatie van de parotis papilla op de 2 cm markering op de PET10. <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Speekselklieren zijn voorgesteld als een weefseldoelplaats voor gentherapie, vooral op het gebied van vaccinatie door genoverdracht. We demonstreren genafgifte in een niet-menselijk primatenmodel met behulp van retrograde parotisinfusie.

Retrograde parotisklierinfusie via het kanaal van Stensen in een niet-menselijke primaat voor vectored genafgifte

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Dit protocol is belangrijk omdat het de procedure van retrograde speekselklierinfusie in detail demonstreert. De procedure kan om verschillende medische redenen worden gebruikt, zoals vectored immunoprofylaxe of gentherapie. Deze techniek is gemakkelijk te leren en te reproduceren.De auteurs zijn erin geslaagd om deze procedure meerdere keren met succes uit te voeren, ondanks het feit dat ze geen kaakchirurgen zijn, noch een dergelijke achtergrond hebben. Gebruik na het verdoven tandloepen voor vergroting en identificeer de parotis papilla of de opening van het kanaal van Stenson op de achterste wang naast de bovenste tweede kies. Verwijd de parotis papilla voorzichtig door de punt van een conische dilatator in het midden of de opening van de papilla te plaatsen en draai de dilatator ongeveer 20 tot 30 seconden heen en weer.Houd vervolgens met een pincet het gemarkeerde uiteinde van de polyethyleenbuis die aan de infusaathoudende spuit is bevestigd op ongeveer 0,5 centimeter van het distale uiteinde en steek voorzichtig de punt van de buis in de verwijde papilla. Breng de buis voorzichtig vooruit met kleine roterende bewegingen om de buizen te laten glijden, gevolgd door het afstellen van het pincet 0,5 centimeter proximaal ten opzichte van de vorige greep. Herhaal dit proces totdat de markering van twee centimeter de parotispapillen bereikt.Om vervolgens de parotis papilla af te sluiten en het morsen van het infundaat terug in de mondholte te verminderen, brengt u een cyanoacrylaat aan op de wang rond de papilla en op de ingebrachte buis. Zodra het cyanoacrylaat droogt, injecteert u het infusaat langzaam gedurende vijf minuten met een snelheid van 100 microliter per minuut. Nadat de infusie is voltooid, laat u de buis ten minste vijf minuten op zijn plaats, waardoor het kanaal afgesloten blijft en het infusaat in de parotisklier blijft.Verwijder ten slotte de buis met zachte tractie en het cyanoacrylaat zal lostrekken met de buis. Fluoroscopie met behulp van een radiocontrastinfuus toonde vertakking van de oplossing door het kanaal van Stenson en in de parotisklier. Immuno als de chemische analyse van de parotisklier onthulde positieve kleuring voor EGFP in zowel de ductale als de acinarcellen, wat wijst op succesvolle transductie en transcriptie in beide celtypen.De belangrijkste uitdaging in deze procedure is waarschijnlijk het in brengen van de polyethyleenbuis in de papilla, wat heel voorzichtig en langzaam moet gebeuren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Voederen van Ticks on Animals voor Transmissie en Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Specifieke Afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde Lung Granulomen

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...