Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier M. Cagney Gentry pour son soutien audiovisuel dans le tournage de la procédure. Nous tenons également à remercier le centre médical Hefner VA pour son soutien académique dans la poursuite de ce projet.

Toutes les procédures ont été effectuées à la Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus pour des études animales. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) a été consulté pour des considérations éthiques et les détails des procédures ont été soumis pour examen. Wake Forest IACUC a approuvé notre protocole d’étude et toutes les procédures ont été effectuées en vertu du protocole approuvé par l’IACUC #A17-147.
1. Préparation du dispos...

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	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Nous décrivons ici un protocole d’infusion rétrograde dans la glande parotide à travers le canal de Stensen. La méthodologie décrite offre des conseils qui peuvent potentiellement être utilisés par les chercheurs qui explorent l’utilité du tissu salivaire en tant que site pour la thérapie génique et d’autres applications.
Il existe plusieurs étapes critiques pour assurer le succès de la procédure. Tout d’abord, toutes les étapes de la procédure doivent être complétées...

Alors que les glandes salivaires sont bien connues pour leur production exocrine de salive, les chercheurs ont depuis longtemps reconnu leur capacité à sécrétionner des protéines directement dans la circulation sanguine1,ce qui en fait une cible potentielle pour la thérapie génique pour l’administration systémique, comme les hormones de remplacement ou la production d’anticorps. En fait, les glandes salivaires offrent plusieurs avantages par rapport à d’autres cibles tissulaires, tels que la capacité inhérente à produire des protéines pour la sécrétion (une propriété qui manque aux muscles), une encapsulation lourde qui peut limiter la diffusion des vecteurs et des tissus bien différenciés assurant la stabilité des vecteurs non intégrateurs. De plus, en cas d’événement indésirable grave, les glandes salivaires ne sont pas critiques pour la vie et peuvent être enlevées chirurgicalement. Bien qu’elles ne soient pas immédiatement intuitives, les glandes parotides sont également facilement accessibles depuis la bouche par leur principal canal excréteur, le canal2de Stensen.
Compte tenu des avantages du tissu salivaire pour la thérapie génique, il y a un intérêt croissant pour l’exploration de cette cible tissulaire. De nombreuses études ont déjà été réalisées sur des modèles de primates rongeurs, canins et non humains et au moins un essai clinique humain est en cours3,4,5. Pour explorer et développer davantage l’utilité de cette cible tissulaire à des fins de thérapie génique, d’autres études sur les primates non humains devront être effectuées. Cet article décrit une méthode d’accès aux glandes parotides par le canal de Stensen pour délivrer un gène vectoriel de transduction dans le modèle de primate non humain. Pour démontrer visiblement l’administration de l’infusate et l’anatomie du canal lorsqu’il pénètre dans la glande, une fluoroscopie à l’aide d’un radiocontraste a été effectuée. Pour démontrer la transduction réussie d’un vecteur, un gène egfp vectoriel adénovirus de sérotype 5 (Ad5) a été utilisé. Ad5 est un vecteur bien décrit capable de transduire le tissu salivaire. Bien qu’il soit trop immunogène pour une utilisation clinique finale, un vecteur Ad5 a été choisi pour cette étude de démonstration afin d’assurer une transduction efficace. L’évaluation de la production de protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) est une méthode bien décrite pour démontrer la transcription et la traduction réussies d’un gène vectoriel après la transduction et a été réalisée ici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

Les glandes salivaires sont une cible tissulaire attrayante pour la thérapie génique avec des résultats prometteurs menant déjà à des essais sur l’homme. Ils sont intrinsèquement capables de sécrétion de protéines dans la circulation sanguine et sont facilement accessibles, ce qui en fait des sites tissulaires potentiellement supérieurs pour la production d’hormones de remplacement ou la vaccination par transfert de gènes. Les méthodes suggérées pour l’administration de gènes comprennent l’injection transcutanée et la perfusion rétrograde par les canaux salivaires. Nous démontrons comment effectuer une perfusion rétrograde de glandes salivaires (RSGI) chez des primates non humains. Nous décrivons les points de repère anatomiques importants, y compris l’identification de la papille parotide, une méthode atraumatique de canulation et de scellement du conduit de Stensen à l’aide d’outils dentaires de base, de tubes en polyéthylène et de cyanoacrylate, et le taux de perfusion approprié. Bien qu’il s’agisse de la méthode d’accouchement la moins traumatisante, la méthode est encore limitée par le volume pouvant être délivré (<0,5 mL) et le risque de traumatisme du canal et de la glande. Nous démontrons par fluoroscopie qu’un infusate peut être entièrement délivré dans la glande, et démontrons en outre par immunohistochimie la transduction d’un vecteur typique et l’expression du gène délivré.

Procédure, transduction et transcription réussies La figure 1 montre la papille parotide adjacente à la 2 e molaire sur la joue supérieurepostérieure. L’image montre également l’emplacement correct de l’attelle buccale, une extrémité en caoutchouc sur le palais dur et l’autre extrémité en caoutchouc sur la canine ipsilatérale. La figure 2 montre une image prise après une canulation réussie de la papille parotid...

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Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Les glandes salivaires ont été proposées comme site cible tissulaire pour la thérapie génique, en particulier dans le domaine de la vaccination par transfert de gènes. Nous démontrons l’administration de gènes dans un modèle de primate non humain utilisant une perfusion parotide rétrograde.

Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Ce protocole est important car il démontre en détail la procédure de perfusion rétrograde des glandes salivaires. La procédure peut être utilisée pour diverses raisons médicales, telles que l’immunoprophylaxie vectorielle ou la thérapie génique. Cette technique est facile à apprendre et à reproduire.Les auteurs ont réussi à effectuer cette procédure avec succès à plusieurs reprises en dépit de ne pas être des chirurgiens buccaux, ni d’avoir une telle expérience. Après anesthésie, utilisez des télescopes dentaires pour le grossissement et identifiez la papille parotide ou l’ouverture du canal de Stenson sur la joue postérieure adjacente à la deuxième molaire supérieure. Dilatez doucement la papille parotide en plaçant la pointe d’un dilatateur conique au centre ou à l’ouverture de la papille et faites pivoter le dilatateur d’avant en arrière pendant environ 20 à 30 secondes.Ensuite, à l’aide d’une pince à épileuse, maintenez l’extrémité marquée du tube en polyéthylène attachée à la seringue contenant de l’infuseur à environ 0,5 centimètre de l’extrémité distale et insérez doucement l’extrémité du tube dans la papille dilatée. Avancez doucement le tube par de petits mouvements de rotation pour aider les tubes à glisser, suivis d’un réajustement de la pince à épile de 0,5 centimètre proximal à la poignée précédente. Répétez ce processus jusqu’à ce que la marque de deux centimètres atteigne la papille parotide.Ensuite, pour sceller la papille parotide et réduire le déversement de l’infusate dans la cavité buccale, appliquez un cyanoacrylate sur la joue autour de la papille et sur le tube inséré. Une fois que le cyanoacrylate sèche, injectez lentement l’infusate pendant cinq minutes à raison de 100 microlitres par minute. Une fois la perfusion terminée, laissez le tube en place pendant au moins cinq minutes, gardant ainsi le canal scellé et permettant à l’infuser de rester dans la glande parotide.Enfin, retirez le tube avec une traction douce et le cyanoacrylate se libérera avec le tube. La fluoroscopie à l’aide d’une perfusion de contraste radio a démontré la ramification de la solution à travers le canal de Stenson et dans la glande parotide. L’immuno, en tant qu’analyse chimique de la glande parotide, a révélé une coloration positive de l’EGFP dans les cellules canalaires et acineuses, ce qui indique une transduction et une transcription réussies dans les deux types de cellules.Le principal défi de cette procédure est probablement d’introduire le tube en polyéthylène dans la papille, ce qui doit être fait très doucement et lentement.

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