Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
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Die Autoren danken Herrn Cagney Gentry für seine audiovisuelle Unterstützung bei den Dreharbeiten. Wir möchten auch das Hefner VA Medical Center für die akademische Unterstützung bei der Verfolgung dieses Projekts anerkennen.

Alle Verfahren wurden an der Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus für Tierversuche durchgeführt. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) wurde aus ethischen Gründen konsultiert und Details der Verfahren wurden zur Überprüfung vorgelegt. Wake Forest IACUC genehmigte unser Studienprotokoll und alle Verfahren wurden unter dem von der IACUC genehmigten Protokoll #A17-147 durchgeführt.
1. Vorbereitung der Infusionsvorrichtung
<ol><li>Größe 10 Polyethylenrohr (PET...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein Protokoll der retrograden Infusion in die Ohrspeicheldrüse durch Stensens Gang. Die beschriebene Methodik bietet eine Anleitung, die möglicherweise von Forschern verwendet werden kann, die den Nutzen von Speichelgewebe als Ort für Gentherapie und andere Anwendungen untersuchen.
Es gibt mehrere kritische Schritte, um den Erfolg des Verfahrens sicherzustellen. In erster Linie sollten alle Verfahrensschritte schonend abgeschlossen werden. Eine kräftige Versteifung des...

Während Speicheldrüsen für ihre exokrine Speichelproduktion bekannt sind, haben Forscher seit langem ihre Fähigkeit erkannt, Proteine direkt in den Blutkreislauf 1 abzusondern, was sie zueinempotenziellen Ziel für die Gentherapie zur systemischen Verabreichung macht, wie Ersatzhormone oder Antikörperproduktion. Tatsächlich bieten Speicheldrüsen mehrere Vorteile gegenüber anderen Gewebezielen, wie die inhärente Fähigkeit, Proteine für die Sekretion zu produzieren (eine Eigenschaft, die Muskeln fehlt), eine starke Verkapselung, die die Vektordiffusion begrenzen kann, und gut differenziertes Gewebe, das Stabilität für nicht integrierende Vektoren bietet. Darüber hinaus sind Speicheldrüsen im Falle eines schwerwiegenden unerwünschten Ereignisses nicht lebenskritisch und können operativ entfernt werden. Obwohl nicht sofort intuitiv, sind Ohrspeicheldrüsen auch leicht vom Mund durch ihren Hauptausscheidungsgang, Stensens Duct2,zugänglich.
Angesichts der Vorteile von Speichelgewebe für die Gentherapie steigt das Interesse an der Erforschung dieses Gewebeziels. Zahlreiche Studien wurden bereits in Nagetier-, Hunde- und nicht-menschlichen Primatenmodellen durchgeführt, und mindestens eine klinische Studie am Menschen ist im Gange3,4,5. Um den Nutzen dieses Gewebeziels für Gentherapiezwecke weiter zu erforschen und zu entwickeln, müssen weitere nicht-menschliche Primatenstudien durchgeführt werden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für den Zugang zu den Ohrspeicheldrüsen durch Stensens Kanal, um ein vektoriertes Gen für die Transduktion im nicht-menschlichen Primatenmodell zu liefern. Um die Abgabe des Infusats und die Anatomie des Kanals beim Eintritt in die Drüse sichtbar zu demonstrieren, wurde eine Durchleuchtung mit Radiokontrast durchgeführt. Um eine erfolgreiche Transduktion eines Vektors nachzuweisen, wurde ein Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) vektorisiertes egfp-Gen verwendet. Ad5 ist ein gut beschriebener Vektor, der in der Lage ist, Speichelgewebe zu transduzieren. Obwohl es für den endgültigen klinischen Einsatz zu immunogen ist, wurde für diese Demonstrationsstudie ein Ad5-Vektor ausgewählt, um eine effiziente Transduktion zu gewährleisten. Die Evaluierung der Produktion von Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) ist eine gut beschriebene Methode zum Nachweis der erfolgreichen Transkription und Translation eines vektorisierten Gens nach der Transduktion und wurde hier durchgeführt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

Speicheldrüsen sind ein attraktives Gewebeziel für die Gentherapie mit vielversprechenden Ergebnissen, die bereits zu Studien am Menschen führen. Sie sind von Natur aus in der Lage, Proteine in den Blutkreislauf zu sezernieren und sind leicht zugänglich, was sie potenziell überlegene Gewebestellen für die Ersatzhormonproduktion oder Impfung durch Gentransfer macht. Vorgeschlagene Methoden für die Genabgabe umfassen die transkutane Injektion und die retrograde Infusion durch Speichelgänge. Wir zeigen, wie retrograde Speicheldrüseninfusion (RSGI) bei nicht-menschlichen Primaten durchgeführt wird. Wir beschreiben die wichtigen anatomischen Orientierungspunkte, einschließlich der Identifizierung der Ohrspeicheldrüsenpapille, einer atraumatischen Methode zum Kanülieren und Versiegeln des Stensen-Kanals unter Verwendung grundlegender zahnärztlicher Werkzeuge, Polyethylenschläuche und Cyanacrylat sowie der entsprechenden Infusionsrate. Während dies die am wenigsten traumatische Methode der Entbindung ist, ist die Methode immer noch durch das Volumen begrenzt, das abgegeben werden kann (<0,5 ml) und das Potenzial für ein Trauma des Kanals und der Drüse. Wir zeigen mit Hilfe der Fluoroskopie, dass ein Infusat vollständig in die Drüse abgegeben werden kann, und zeigen durch Immunhistochemie die Transduktion eines typischen Vektors und die Expression des gelieferten Gens.

Erfolgreiches Verfahren, Transduktion und Transkription Abbildung 1 zeigt die Ohrspeicheldrüsenpapille neben dem2. Backenzahn auf der hinteren oberen Wange. Das Bild zeigt auch die korrekte Platzierung der Mundorthese, ein Gummiende am harten Gaumen und das andere Gummiende am ipsilateralen Hund. Abbildung 2 zeigt ein Bild, das nach erfolgreicher Kanulation der Ohrspeicheldrüsenpapille an der 2-cm-Markierung auf dem PET10 aufgeno...

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Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Speicheldrüsen wurden als Gewebezielstelle für die Gentherapie vorgeschlagen, insbesondere im Bereich der Impfung durch Gentransfer. Wir demonstrieren die Genabgabe in einem nicht-menschlichen Primatenmodell mit retrograder Ohrspeicheldrüseninfusion.

Retrograde Ohrspeicheldrüseninfusion durch Stensen-Kanal in einem nicht-menschlichen Primaten für vektorierte Genabgabe

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es das Verfahren der retrograden Speicheldrüseninfusion im Detail demonstriert. Das Verfahren kann aus einer Vielzahl von medizinischen Gründen eingesetzt werden, wie z.B. vektorisierter Immunprophylaxe oder Gentherapie. Diese Technik ist leicht zu erlernen und zu reproduzieren.Den Autoren ist es gelungen, dieses Verfahren mehrfach erfolgreich durchzuführen, obwohl sie weder Oralchirurgen noch einen solchen Hintergrund haben. Nach der Betäubung verwenden Sie Zahnlupen zur Vergrößerung und identifizieren Sie die Ohrspeicheldrüsenpapille oder die Öffnung des Stenson-Kanals auf der hinteren Wange neben dem oberen zweiten Backenzahn. Erweitern Sie vorsichtig die Ohrspeicheldrüsenpapille, indem Sie die Spitze eines konischen Dilatators in die Mitte oder Öffnung der Papille legen und den Dilatator für etwa 20 bis 30 Sekunden hin und her drehen.Als nächstes halten Sie mit einer Pinzette das markierte Ende des Polyethylenröhrchens, das an der infusathaltigen Spritze befestigt ist, etwa 0,5 Zentimeter vom distalen Ende entfernt und führen Sie die Spitze des Röhrchens vorsichtig in die erweiterte Papille ein. Bewegen Sie das Rohr vorsichtig durch kleine Drehbewegungen voran, um die Röhren beim Gleiten zu unterstützen, gefolgt von einer Nachjustierung der Pinzette um 0,5 Zentimeter proximal zum vorherigen Griff. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Zwei-Zentimeter-Marke die Ohrspille erreicht.Um die Ohrspeicheldrüsenpapille zu versiegeln und das Verschütten des Infusats in der Mundhöhle zu reduzieren, tragen Sie ein Cyanacrylat auf die Wange um die Papille und auf den eingeführten Schlauch auf. Sobald das Cyanacrylat trocknet, injizieren Sie das Infusat langsam über fünf Minuten mit einer Rate von 100 Mikrolitern pro Minute. Nachdem die Infusion abgeschlossen ist, lassen Sie den Schlauch mindestens fünf Minuten an Ort und Stelle, wodurch der Kanal verschlossen bleibt und das Infusat in der Ohrspeicheldrüse verbleibt.Zum Schluss das Rohr mit sanfter Traktion entfernen und das Cyanacrylat zieht mit dem Rohr frei. Die Durchleuchtung mit einer Radiokontrastinfusion zeigte eine Verzweigung der Lösung durch den Stenson-Kanal und in die Ohrspeicheldrüse. Immuno, da die chemische Analyse der Ohrspeicheldrüse eine positive Färbung für EGFP sowohl in den duktalen als auch in den acinaren Zellen ergab, was auf eine erfolgreiche Transduktion und Transkription in beiden Zelltypen hinweist.Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren besteht wahrscheinlich darin, das Polyethylenrohr in die Papille einzuführen, was sehr sanft und langsam erfolgen sollte.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

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Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

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The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

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Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

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Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

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A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

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Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...