Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

המחברים רוצים להודות למר קגני ג'נטרי על תמיכתו האודיו-קולית בצילומי ההליך. אנחנו גם רוצים להכיר במרכז הרפואי הפנר VA לתמיכה אקדמית במרדף אחר פרויקט זה.

כל ההליכים בוצעו בקמפוס קלרקסון של בית הספר לרפואה ווייק פורסט ללימודי בעלי חיים. הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) התייעצה משיקולים אתיים ופרטי ההליכים הוגשו לעיון. Wake Forest IACUC אישר את פרוטוקול המחקר שלנו וכל ההליכים נעשו תחת פרוטוקול שאושר על ידי IACUC #A17-147.
1. הכנת מ...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

כאן אנו מתארים פרוטוקול של עירוי מדרדר לתוך בלוטת הפרוטיד דרך צינור סטנסן. המתודולוגיה המתוארת מציעה הדרכה שיכולה לשמש חוקרים החוקרים את התועלת של רקמת הרוק כאתר לטיפול גנטי ויישומים אחרים.
ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח את הצלחת ההליך. בראש ובראשונה, יש להשלים בעדינות...

בעוד בלוטות הרוק ידועים בייצור האקסוקריני שלהם של רוק, חוקרים מזה זמן רב זיהו את יכולתם להפריש חלבונים ישירות למחזור הדם 1 , מהשהופךאותם למטרה פוטנציאלית לטיפול גנטי לניהול מערכתי, כגון הורמונים חלופיים או ייצור נוגדנים. למעשה, בלוטות הרוק מציעות מספר יתרונות על פני מטרות רקמות אחרות, כגון היכולת הטבועה לייצר חלבונים להפרשה (חסר שרירי רכוש), אנקפסולציה כבדה שיכולה להגביל דיפוזיה וקטורית, ורקמות מובחנות היטב המספקות יציבות לווקטורים שאינם משתלבים. יתר על כן, במקרה של אירוע לוואי חמור, בלוטות הרוק אינן קריטיות לחיים וניתן להסירן בניתוח. אמנם לא אינטואיטיבי מיד, בלוטות פרוטידים נגישים גם מהפה דרך צינור ההפרשה הראשי שלהם, צינור2של סטנסן .
בהתחשב ביתרונות של רקמת הרוק לטיפול גנטי, יש עניין גובר לחקור את יעד הרקמה הזה. מחקרים רבים כבר בוצעו במודלים של מכרסמים, כלבים ופרימטים לא אנושיים ולפחות ניסוי קליני אחד בבני אדם נמצא בעיצומו3,4,5. כדי להמשיך לחקור ולפתח את התועלת של יעד רקמות זה למטרות ריפוי גנטי, יותר מחקרים פרימטים שאינם אנושיים יצטרכו להתבצע. מאמר זה מתאר שיטה לגישה לבלוטות הפרוטידים דרך צינור סטנסן כדי לספק גן וקטורי להחלפת מודל הפרימטים הלא אנושי. כדי להדגים באופן ניכר את המסירה של infusate ואת האנטומיה של הצינור כפי שהוא נכנס בלוטה, פלואורוסקופיה באמצעות radiocontrast בוצע. כדי להדגים טרנסולציה מוצלחת של וקטור, נעשה שימוש בגן egfp וקטורי של אדנווירוס 5 (Ad5). Ad5 הוא וקטור מתואר היטב המסוגל לבצע חילוף של רקמת רוק. למרות שזה אימונוגני מדי לשימוש קליני אולטימטיבי, וקטור Ad5 נבחר למחקר הדגמה זה כדי להבטיח טרנסולמה יעילה. הערכת ייצור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) היא שיטה המתוארת היטב כדי להדגים שעתוק ותרגום מוצלחים של גן וקטורי לאחר התמרה ונעשה כאן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

בלוטות הרוק הן יעד רקמות אטרקטיבי לטיפול גנטי עם תוצאות מבטיחות כבר מוביל לניסויים בבני אדם. הם מסוגלים מטבעם להפריש חלבונים למחזור הדם והם נגישים בקלות, מה שהופך אותם לאתרי רקמות מעולים פוטנציאליים לייצור הורמונים חלופיים או חיסון על ידי העברת גנים. שיטות מוצעות להעברת גנים כוללות הזרקה עורית ועירוי מדרדר דרך צינורות רוק. אנו מדגימים כיצד לבצע עירוי בלוטת הרוק מדרדר (RSGI) בפרימטים שאינם אנושיים. אנו מתארים את ציוני הדרך האנטומיים החשובים כולל זיהוי של הפפילה הפרוטידית, שיטה אטארומטית של שינון ואיטום צינור סטנסן תוך שימוש בכלים דנטליים בסיסיים, צינורות פוליאתילן ו cyanoacrylate, ואת השיעור המתאים של עירוי. אמנם זוהי שיטת המסירה הפחות טראומטית, אך השיטה עדיין מוגבלת על ידי הנפח המסוגלת להימסר (<0.5 מ"ל) והפוטנציאל לטראומה לצינור ובבלוטות. אנו מדגימים באמצעות פלואורוסקופיה כי אינפוזאט יכול להיות מועבר באופן מלא לתוך הבלוטה, ולהדגים עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה את transduction של וקטור טיפוסי ביטוי של הגן נמסר.

הליך מוצלח, התמרה ותעתיק איור 1 מציג את הפאפילה הפרוטידית הצמודה לאוחנתהשנייה על הלחי העליונה האחורית. התמונה מציגה גם את המיקום הנכון של סד הפה, קצה גומי אחד על החיך הקשה ואת קצה הגומי השני על הכלב ipsilateral. איור 2 מציג תמונה שצולמה לאחר שינון ?...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

בלוטות הרוק הוצעו כאתר יעד לרקמות לטיפול גנטי, במיוחד בתחום החיסון על ידי העברת גנים. אנו מדגימים אספקת גנים במודל פרימטים לא אנושיים המשתמש בעירוי פרוטידים מדרדר.

עירוי בלוטת פרוטידים מדרדר דרך צינור סטנסן בפרימט לא אנושי לאספקת גנים וקטורית

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

פרוטוקול זה חשוב כי זה מדגים את ההליך של עירוי בלוטת הרוק מדרדר בפירוט. ההליך יכול לשמש ממגוון סיבות רפואיות, כגון אימונופרופיליקסיס וקטורי או טיפול גנטי. טכניקה זו קלה ללמוד ולהתרבות.המחברים הצליחו לבצע הליך זה בהצלחה בהזדמנויות רבות למרות שלא היו מנתחי פה, ולא היה להם רקע כזה. לאחר המרדים להשתמש זכוכית שיניים להגדלה ולזהות את papilla פרוטידי או את פתיחת צינור סטנסון על הלחי האחורית הסמוכה לטוחנת השנייה העליונה. מרחיבים בעדינות את הפפילה הפרוטידית על ידי הצבת הנקודה של מרחיב חרוט במרכז או בפתיחת הפפילה ומסובבים את המרחיב קדימה ואחורה למשך כ-20 עד 30 שניות.לאחר מכן, באמצעות פינצטה להחזיק את הקצה המסומן של צינור פוליאתילן מחובר מזרק המכיל infusate בכ 0.5 ס"מ מן הקצה דיסטלי בעדינות להכניס את קצה הצינור לתוך הפפילה המופרכת. לקדם בעדינות את הצינור על ידי תנועות סיבוב קטנות כדי לעזור לצינורות להחליק, ואחריו הסתגלות מחדש של פינצטה 0.5 ס"מ קרוב לאחיזה הקודמת. חזור על תהליך זה עד שסימן שני הסנטימטרים מגיע לפפילה הפרוטידים.לאחר מכן, כדי לאטום את הפפילה הפרוטידית ולהפחית את שפיכת החדירה בחזרה בחלל הפה, להחיל ציאנואקרילט על הלחי סביב הפפילה ועל הצינור המוחדר. ברגע הציאנואקרילאט מתייבש, הזריקו לאט לאט את החדירה במשך חמש דקות בקצב של 100 מיקרוליטרים לדקה. לאחר עירוי הושלם, להשאיר את הצינור במקום לפחות חמש דקות, ובכך לשמור על הצינור אטום ומאפשר infusate להישאר בבלוטה פרוטיד.לבסוף, להסיר את הצינור עם המתיחה העדינה ואת cyanoacrylate ימשוך חופשי עם הצינור. פלואורוסקופיה באמצעות עירוי ניגודיות רדיו הדגים הסתעפות של הפתרון דרך צינור סטנסון לתוך בלוטת הפרוטיד. אימונו כניתוח הכימי של בלוטת הפרוטידים גילה כתמים חיוביים עבור EGFP הן בתאי הרקיע והן בתאי האצין המצביעים על טרנסדוקציה ותעתיק מוצלחים בשני סוגי התאים.האתגר העיקרי בהליך זה הוא כנראה החדרת צינור פוליאתילן לתוך הפפילה, אשר צריך להיעשות בעדינות רבה לאט.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...