Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
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Gli autori vogliono ringraziare il signor Cagney Gentry per il suo supporto audiovisivo nelle riprese della procedura. Vogliamo anche riconoscere il centro medico Hefner VA per il supporto accademico nel perseguimento di questo progetto.

Tutte le procedure sono state eseguite presso la Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus per gli studi sugli animali. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) è stato consultato per considerazioni etiche e i dettagli delle procedure sono stati sottoposti a revisione. Wake Forest IACUC ha approvato il nostro protocollo di studio e tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo approvato IACUC #A17-147.
1. Preparazione del dispositivo per infusione<...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Qui descriviamo un protocollo di infusione retrograda nella ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen. La metodologia descritta offre una guida che può potenzialmente essere utilizzata dai ricercatori che esplorano l'utilità del tessuto salivare come sito per la terapia genica e altre applicazioni.
Ci sono diversi passaggi critici per garantire il successo della procedura. Innanzitutto, tutte le fasi procedurali dovrebbero essere completate delicatamente. Un rinforzo forzato della bo...

Mentre le ghiandole salivari sono ben note per la loro produzione esocrina di saliva, i ricercatori hanno da tempo riconosciuto la loro capacità di secernere proteine direttamente nel flusso sanguigno1, rendendole un potenziale bersaglio per la terapia genica per la somministrazione sistemica, come ormoni sostitutivi o produzione di anticorpi. In effetti, le ghiandole salivari offrono diversi vantaggi rispetto ad altri bersagli tissutali, come la capacità intrinseca di produrre proteine per la secrezione (una proprietà che manca ai muscoli), l'incapsulamento pesante che può limitare la diffusione del vettore e il tessuto ben differenziato che fornisce stabilità per i vettori non integranti. Inoltre, in caso di evento avverso grave, le ghiandole salivari non sono critiche per la vita e possono essere rimosse chirurgicamente. Sebbene non siano immediatamente intuitive, le ghiandole parotidi sono anche facilmente accessibili dalla bocca attraverso il loro principale dotto escretore, il dotto di Stensen2.
Dati i vantaggi del tessuto salivare per la terapia genica, c'è un crescente interesse nell'esplorare questo bersaglio tissutale. Numerosi studi sono già stati condotti in modelli di primati roditori, canini e non umani e almeno uno studio clinico umano è in corso3,4,5. Per esplorare ulteriormente e sviluppare l'utilità di questo bersaglio tissutale ai fini della terapia genica, saranno necessari ulteriori studi sui primati non umani. Questo articolo descrive un metodo per accedere alle ghiandole parotidi attraverso il dotto di Stensen per fornire un gene vettoriale per la trasduzione nel modello di primate non umano. Per dimostrare visibilmente la consegna dell'infuso e l'anatomia del dotto quando entra nella ghiandola, è stata eseguita la fluoroscopia con radiocontrasto. Per dimostrare la trasduzione riuscita di un vettore, è stato utilizzato un gene egfp vettoriale di sierotipo 5 (Ad5) adenovirus. Ad5 è un vettore ben descritto in grado di trasdurre il tessuto salivare. Sebbene sia troppo immunogenico per l'uso clinico finale, per questo studio dimostrativo è stato scelto un vettore Ad5 per assicurare una trasduzione efficiente. La valutazione della produzione di Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) è un metodo ben descritto per dimostrare il successo della trascrizione e della traduzione di un gene vettoriale dopo la trasduzione ed è stato fatto qui.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

Le ghiandole salivari sono un bersaglio tissutale attraente per la terapia genica con risultati promettenti che già portano a studi sull'uomo. Sono intrinsecamente in grado di secernere proteine nel flusso sanguigno e sono facilmente accessibili, rendendoli siti tissutali potenzialmente superiori per la produzione di ormoni sostitutivi o la vaccinazione mediante trasferimento genico. I metodi suggeriti per la somministrazione genica includono l'iniezione transcutanea e l'infusione retrograda attraverso i dotti salivari. Dimostriamo come eseguire l'infusione retrograda delle ghiandole salivari (RSGI) in primati non umani. Descriviamo gli importanti punti di riferimento anatomici tra cui l'identificazione della papilla parotide, un metodo atraumatico di cannulazione e sigillatura del dotto di Stensen utilizzando strumenti dentali di base, tubi in polietilene e cianoacrilato e la velocità appropriata di infusione. Mentre questo è il metodo di consegna meno traumatico, il metodo è ancora limitato dal volume in grado di essere consegnato (<0,5 ml) e dal potenziale trauma al dotto e alla ghiandola. Dimostriamo usando la fluoroscopia che un infusato può essere completamente consegnato nella ghiandola e dimostriamo ulteriormente con l'immunoistochimica la trasduzione di un vettore tipico e l'espressione del gene consegnato.

Procedura, trasduzione e trascrizione di successo La Figura 1 mostra la papilla parotide adiacente al 2° molare sulla guancia superiore posteriore. L'immagine mostra anche il corretto posizionamento del tutore della bocca, un'estremità di gomma sul palato duro e l'altra estremità di gomma sul cane ipsilaterale. La Figura 2 mostra un'immagine scattata dopo il successo della cannulazione della papilla parotide al segno di 2 cm sul...

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Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Le ghiandole salivari sono state proposte come sito bersaglio tissutale per la terapia genica, specialmente nell'area della vaccinazione mediante trasferimento genico. Dimostriamo la consegna genica in un modello di primate non umano utilizzando l'infusione retrograda di parotidi.

Infusione retrograda della ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen in un primate non umano per la consegna di geni vettoriali

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Questo protocollo è importante perché dimostra in dettaglio la procedura di infusione retrograda delle ghiandole salivari. La procedura può essere utilizzata per una serie di motivi medici, come l'immunoprofilassi vettoriale o la terapia genica. Questa tecnica è facile da imparare e riprodurre.Gli autori sono riusciti a eseguire questa procedura con successo in più occasioni nonostante non fossero chirurghi orali, né avessero un tale background. Dopo l'anestesia utilizzare lenti dentali per l'ingrandimento e identificare la papilla parotide o l'apertura del dotto di Stenson sulla guancia posteriore adiacente al secondo molare superiore. Dilatare delicatamente la papilla parotide posizionando la punta di un dilatatore conico al centro o all'apertura della papilla e ruotare il dilatatore avanti e indietro per circa 20-30 secondi.Successivamente, utilizzando una pinzetta tenere l'estremità marcata del tubo di polietilene attaccato alla siringa contenente infusato a circa 0,5 centimetri dall'estremità distale e inserire delicatamente la punta del tubo nella papilla dilatata. Far avanzare delicatamente il tubo con piccoli movimenti rotanti per aiutare i tubi a scivolare, seguiti da riregolazione delle pinzette di 0,5 centimetri prossimali alla presa precedente. Ripeti questo processo fino a quando il segno di due centimetri raggiunge la papilla parotide.Successivamente, per sigillare la papilla parotide e ridurre la fuoriuscita dell'infusato nella cavità orale, applicare un cianoacrilato sulla guancia intorno alla papilla e sul tubo inserito. Una volta che il cianoacrilato si asciuga, iniettare lentamente l'infuso per cinque minuti ad una velocità di 100 microlitri al minuto. Al termine dell'infusione, lasciare il tubo in posizione per almeno cinque minuti, mantenendo così il condotto sigillato e permettendo all'infusato di rimanere nella ghiandola parotide.Infine, rimuovere il tubo con una trazione delicata e il cianoacrilato tirerà libero con il tubo. La fluoroscopia mediante infusione di contrasto radio ha dimostrato la ramificazione della soluzione attraverso il dotto di Stenson e nella ghiandola parotide. Immuno come l'analisi chimica della ghiandola parotide ha rivelato una colorazione positiva per EGFP sia nelle cellule duttali che acino, indicando una trasduzione e una trascrizione di successo in entrambi i tipi di cellule.La sfida principale in questa procedura è probabilmente l'introduzione del tubo di polietilene nella papilla, che dovrebbe essere fatto molto delicatamente e lentamente.

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