Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
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著者らは、手順の撮影における彼の視聴覚サポートのためにキャグニー・ジェントリー氏に感謝したいと考えています。また、このプロジェクトを追求するヘフナーVA医療センターの学術支援を認めたいと考えています。

すべての手順は、動物研究のためにウェイクフォレスト医学部クラークソンキャンパスで行われました。制度的動物管理・使用委員会(IACUC)は倫理的配慮について協議され、手続きの詳細は審査のために提出された。ウェイクフォレストIACUCは、私たちの研究プロトコルを承認し、すべての手順は、IACUC承認プロトコル#A17-147の下で行われました。
1. 輸液装置の準備
<ol><li...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

ここでは、ステンセンのダクトを介して耳下腺への逆行注入のプロトコルについて説明します。説明された方法論は、遺伝子治療やその他のアプリケーションの部位として唾液組織の有用性を探求する研究者によって潜在的に使用することができるガイダンスを提供する。
この手順を成功させるためには、複数の重要な手順があります。まず第一に、すべての手順は穏?...

唾液腺は唾液の外分泌産生でよく知られていますが、研究者は長い間、タンパク質を血流1に直接分泌する能力を認識しており、置換ホルモンや抗体産生などの全身投与のための遺伝子治療の潜在的な標的となっています。実際、唾液腺は、分泌のためのタンパク質を産生する固有の能力(プロパティ筋不足)、ベクター拡散を制限できる重いカプセル化、非統合ベクターの安定性を提供する十分に分化された組織など、他の組織ターゲットに対していくつかの利点を提供します。さらに、重篤な有害事象が発生した場合、唾液腺は生命にとって重要ではなく、外科的に除去することができる。直ちに直ぐには直視できないが、耳下腺は口から主な排泄管、ステンセンのダクト2を通して容易にアクセスできる。
遺伝子治療のための唾液組織の利点を考えると、この組織標的を探索することに関心が高まっている。げっ歯類、イヌ、ヒト以外の霊長類モデルでは既に数多くの研究が行われ、少なくとも1つのヒト臨床試験が3、4、5で進行中である。遺伝子治療目的のためにこの組織標的の有用性をさらに探求し、開発するためには、より多くの非ヒト霊長類研究が行われる必要がある。本論文では、Stensenのダクトを介して、アオシド腺にアクセスし、非ヒト霊長類モデルにおける形質導入のためのベクター化遺伝子を送達する方法について述べている。腺に入る場合のインフューズートの送達及びダクトの解剖学を目に見えて実証するために、放射コントラストを用いた蛍光視が行われた。ベクターの正常な伝達を実証するために、アデノウイルス血清型5(Ad5)ベクター化egfp遺伝子を用いた。Ad5は、唾液組織を導入し得る、よく説明したベクターである。究極の臨床使用には免疫原性が高すぎるが、効率的な導入を保証するためにこの実証研究のためにAd5ベクターが選ばれた。強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の生産を評価することは、転写後のベクター遺伝子の転写と翻訳を成功させたことを実証するためのよく説明された方法であり、ここで行われました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

唾液腺は、すでにヒトの試験につながる有望な結果を有する遺伝子治療のための魅力的な組織標的である。彼らは本質的に血流中にタンパク質を分泌することができ、容易にアクセス可能であり、遺伝子導入による置換ホルモン産生またはワクチン接種のための潜在的に優れた組織サイトを作る。遺伝子導入の推奨方法としては、唾液管を介した経皮注射および逆行注入が挙げられる。ヒト以外の霊長類で逆行唾液腺注入(RSGI)を行う方法を実演する。我々は、耳下腺乳頭の同定、基本的な歯科用具、ポリエチレンチューブ、シアノアクリル酸塩を利用したステンセンのダクトをカニューララットおよびシールする無外傷性方法、および適切な注入速度を含む重要な解剖学的ランドマークを記述する。これは最も外傷性の低い送達方法ですが、この方法は、引き渡し可能な体積(<0.5 mL)と、ダクトおよび腺への外傷の可能性によって依然として制限されています。蛍光検査を用いて、蛍光検査を用いて、インフューズトを完全に腺に送達できることを実証し、免疫体系化学によって、典型的なベクターの導入と、送達された遺伝子の発現を更に実証する。

成功した手順、伝達および転写 図1 は、後部上頬の2番目 の大臼歯に隣接する耳下腺乳頭を示す。画像はまた、口のブレースの正しい配置を示しています, 硬口蓋に一方のゴム端とイプシラテラレのイプシラテラの上に他のゴム端. 図2 は、PET10上の2cmマークでの耳蓋乳頭のカヌリン化に成功した後に撮影した画像を示す。 <str...

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Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

唾液腺は、遺伝子治療の組織標的部位として、特に遺伝子導入によるワクチン接種の領域において提案されている。逆行性の耳下腺注入を利用した非ヒト霊長類モデルにおける遺伝子導入を実証する。

ベクター化遺伝子導入のための非ヒト霊長類におけるステンセンダクトによる逆行性耳下腺注入

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

このプロトコルは、唾液腺逆行注入の手順を詳細に示すため重要である。この手順は、ベクター化免疫予防や遺伝子治療などの様々な医学的理由で使用することができます。このテクニックは、簡単に学習し、再現できます。著者らは、口腔外科医ではないにもかかわらず、そのような背景を持っていないにもかかわらず、何度もこの手順を正常に実行することができました。麻酔後、拡大のために歯科ループを使用し、上部第2臼歯に隣接する後頬の耳下蓋乳頭またはステンソンのダクトの開口部を特定する。円錐形のディレーターの点を中央に置くか、乳頭を開いて、約20〜30秒間、前後にディラタを回すことによって、耳蓋乳頭を穏やかに拡張します。次に、遠位端から約0.5センチメートルで注射器を含むインフューズを含むインフューズを取り付けたポリエチレンチューブの印の端を保持するピンセットを使用し、チューブの先端を軽く拡張乳頭に挿入します。チューブがスライドするのを助けるために小さな回転運動によってチューブを穏やかに進め、続いてピンセットの0.5センチメートル近位を前のグリップに再調整します。2センチマークが耳下腺乳頭に達するまで、このプロセスを繰り返します。次に、耳下腺乳頭を密封し、口腔内に戻るインフュージングのこぼれを減らし、乳頭の周りおよび挿入管の頬にシアノアクリルを塗布する。シアノクリレートが乾燥したら、1分間に100マイクロリットルの速度で5分間にわたって徐煙をゆっくりと注入します。注入が完了した後、チューブを少なくとも5分間所定の位置に残し、それによってダクトを密閉し、インフュージングが耳下腺に残るようにします。最後に、穏やかな牽引力でチューブを取り外すと、シアノアクリルはチューブで自由に引っ張ります。無線コントラスト注入を用いた蛍光検査は、ステンソンのダクトを通って耳下腺に溶液の分岐を実証した。耳下腺の化学分析としての免疫は、両方の細胞タイプにおける正常な転移および転写を示す管および共生細胞の両方でEGFPの陽性染色を明らかにした。この手順の主な課題は、おそらく非常に穏やかにゆっくりと行われるべき乳頭にポリエチレンチューブを導入することです。

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