Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Forfatterne vil takke Mr. Cagney Gentry for hans audiovisuelle støtte til å filme prosedyren. Vi ønsker også å anerkjenne Hefner VA medisinske senter for faglig støtte i jakten på dette prosjektet.

Alle prosedyrene ble utført ved Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus for dyrestudier. Institusjonell dyrepleie- og brukskomité (IACUC) ble konsultert for etiske hensyn og detaljer om prosedyrene ble sendt inn til gjennomgang. Wake Forest IACUC godkjente vår studieprotokoll og alle prosedyrer ble gjort under IACUC-godkjent protokoll #A17-147.
1. Klargjøring av infusjonsenheten
<ol><li>Klipp størrelse 10 Polyetylen Tube (PET10) i 25 cm lengder ved hjelp av en saks.</li>
	<li>Mer...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Her beskriver vi en protokoll for retrograd infusjon i parotidkjertelen gjennom Stensens kanal. Den beskrevne metodikken gir veiledning som potensielt kan brukes av forskere som utforsker nytten av spyttvev som et sted for genterapi og andre anvendelser.
Det er flere kritiske trinn for å sikre at prosedyren lykkes. Først og fremst bør alle prosedyretrinnene fullføres forsiktig. Kraftig avstivning av munnen kan føre til mandibulær subluxasjon. Kraftig kanylering av parotid papilla eller r...

Mens spyttkjertler er kjent for sin eksokrinproduksjon av spytt, har forskere lenge anerkjent sin evne til å skille ut proteiner direkte i blodet1, noe som gjør dem til et potensielt mål for genterapi for systemisk administrasjon, for eksempel erstatningshormoner eller antistoffproduksjon. Faktisk tilbyr spyttkjertler flere fordeler i forhold til andre vevsmål, for eksempel den iboende evnen til å produsere proteiner for sekresjon (en eiendomsmuskulatur mangler), tung innkapsling som kan begrense vektordiffusjon, og godt differensiert vev som gir stabilitet for ikke-integrerende vektorer. Videre, i tilfelle en alvorlig bivirkning, er spyttkjertler ikke kritiske for livet og kan fjernes kirurgisk. Selv om de ikke umiddelbart er intuitive, er parotidkjertler også lett tilgjengelige fra munnen gjennom hovedutskillelseskanalen, Stensens kanal2.
Gitt fordelene med spyttvev for genterapi, er det økende interesse for å utforske dette vevsmålet. Tallrike studier har allerede blitt utført i gnager-, hunde- og ikke-menneskelige primatmodeller, og minst en menneskelig klinisk studie er i gang3,4,5. For å utforske og utvikle nytten av dette vevsmålet for genterapiformål, må flere ikke-menneskelige primatstudier utføres. Dette dokumentet beskriver en metode for å få tilgang til parotidkjertlene gjennom Stensens kanal for å levere et vektorisert gen for transduksjon i den ikke-menneskelige primatmodellen. For å synlig demonstrere leveransen av infusatet og kanalens anatomi når den kommer inn i kjertelen, ble fluoroskopi ved hjelp av radiokontrast utført. For å demonstrere vellykket transduksjon av en vektor, ble en Adenovirus serotype 5 (Ad5) vektorisert egfp gen brukt. Ad5 er en godt beskrevet vektor som er i stand til å transdusere spyttvev. Selv om det er for immunogent for optimal klinisk bruk, ble en Ad5-vektor valgt for denne demonstrasjonsstudien for å sikre effektiv transduksjon. Evaluering av enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) produksjon er en godt beskrevet metode for å demonstrere vellykket transkripsjon og oversettelse av et vektorisert gen etter transduksjon og ble gjort her.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

Spyttkjertler er et attraktivt vevsmål for genterapi med lovende resultater som allerede fører til menneskelige studier. De er iboende i stand til å utskille proteiner i blodet og er lett tilgjengelige, noe som gjør dem potensielt overlegne vevssteder for erstatningshormonproduksjon eller vaksinasjon ved genoverføring. Foreslåtte metoder for genlevering inkluderer transkutan injeksjon og retrograd infusjon gjennom spyttkanaler. Vi demonstrerer hvordan du utfører Retrograde Salivary Gland Infusion (RSGI) hos ikke-menneskelige primater. Vi beskriver de viktige anatomiske landemerkene, inkludert identifisering av parotid papilla, en atraumatisk metode for kanylering og tetting av Stensens kanal ved hjelp av grunnleggende tannverktøy, polyetylenrør og cyanoakrylat, og riktig infusjonshastighet. Selv om dette er den minst traumatiske leveringsmåten, er metoden fortsatt begrenset av volumet som kan leveres (<0,5 ml) og potensialet for traumer til kanalen og kjertelen. Vi demonstrerer ved hjelp av fluoroskopi at et infusat kan leveres fullt ut i kjertelen, og videre demonstrere ved immunhiistokjemi transduksjonen av en typisk vektor og uttrykk for det leverte genet.

Vellykket prosedyre, transduksjon og transkripsjon Figur 1 viser parotid papillaen ved siden av denandre molaren på det bakre overlegne kinnet. Bildet viser også riktig plassering av munnstøtten, den ene gummienden på den harde ganen og den andre gummienden på den ipsilaterale hunden. Figur 2 viser et bilde tatt etter vellykket kanylering av parotid papilla ved 2 cm-merket på PET10. Figur 3 viser...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Spyttkjertler har blitt foreslått som et vevsmålsted for genterapi, spesielt innen vaksinasjon ved genoverføring. Vi demonstrerer gentilførsel i en ikke-menneskelig primatmodell ved hjelp av retrograd parotidinfusjon.

Retrograd parotidkjertelinfusjon gjennom Stensens kanal i en ikke-menneskelig primat for vektorisert genlevering

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Denne protokollen er viktig fordi den demonstrerer prosedyren for retrograd spyttkjertelinfusjon i detalj. Prosedyren kan brukes av en rekke medisinske årsaker, for eksempel vektorisert immunopropylakse eller genterapi. Denne teknikken er lett å lære og reprodusere.Forfatterne har klart å utføre denne prosedyren vellykket ved flere anledninger til tross for at de ikke er orale kirurger, og heller ikke har noen slik bakgrunn. Etter bedøvelse bruk dental loupes for forstørrelse og identifisere parotid papilla eller åpningen av Stensons kanal på bakre kinn ved siden av øvre andre molar. Fortynn forsiktig parotid papillaen ved å plassere punktet på en konisk dilatator i midten eller åpningen av papillaen og roter dilatatoren frem og tilbake i ca. 20 til 30 sekunder.Deretter holder bruk av pinsett den markerte enden av polyetylenrøret festet til den infusate som inneholder sprøyten på ca. 0,5 centimeter fra den distale enden og setter forsiktig tuppen av røret inn i den utvidede papillaen. Før røret forsiktig frem med små roterende bevegelser for å hjelpe rørene til å gli, etterfulgt av justering av pinsettene 0,5 centimeter proksimalt til forrige grep. Gjenta denne prosessen til to centimeter-merket når parotid papillaen.Deretter, for å forsegle parotid papilla og redusere søl av infusate tilbake i munnhulen, påfør en cyanoacrylat på kinnet rundt papillaen og på det innsatte røret. Når cyanoacrylaten tørker, injiserer du langsomt infusatet over fem minutter med en hastighet på 100 mikroliter per minutt. Etter at infusjonen er fullført, la røret være på plass i minst fem minutter, og hold dermed kanalen forseglet og la infusatet forbli i parotidkjertelen.Til slutt fjerner du røret med forsiktig trekkraft, og cyanoacrylaten vil trekke seg fri med røret. Fluoroskopi ved hjelp av en radiokontrastinfusjon demonstrerte forgrening av oppløsningen gjennom Stensons kanal og inn i parotidkjertelen. Immuno som kjemisk analyse av parotidkjertelen avslørte positiv farging for EGFP i både kanal- og acinarceller som indikerer vellykket transduksjon og transkripsjon i begge celletyper.Hovedutfordringen i denne prosedyren er sannsynligvis å introdusere polyetylenrøret i papillaen, som bør gjøres veldig forsiktig og sakte.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Anerkjennelse av epidermal Transglutaminase av IgA og Tissue Transglutaminase to antistoffer i et sjeldent tilfelle av Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Et restriksjonsenzym Basert Cloning metode for å vurdere den<em&gt; In vitro</em&gt; Replication Kapasitet av HIV-1 Undertype C gag-MJ4 Chimerisk virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

En roman microdissection tilnærming til Gjenopprette<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spesifikke Utskrift fra formalinfiksert parafin Embedded Lung Granulomer

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Mesentriske Lymfe Duct kannulert Rat Modell: Søknad til Vurdering av Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi for utvikling av Adenovirus Serotype 5-vectored Vaksine tilnærminger

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...