Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Os autores querem agradecer ao Sr. Cagney Gentry por seu apoio audiovisual na filmagem do procedimento. Também queremos reconhecer o centro médico Hefner VA para apoio acadêmico em busca deste projeto.

Todos os procedimentos foram realizados na Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus para estudos em animais. O Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) foi consultado para considerações éticas e detalhes dos procedimentos foram submetidos à revisão. A Wake Forest IACUC aprovou nosso protocolo de estudo e todos os procedimentos foram feitos sob o protocolo aprovado pela IACUC #A17-147.
1. Preparando o dispositivo de infusão
<ol><li>Corte tamanho 10 Tubo de polie...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Aqui descrevemos um protocolo de infusão retrógrada na glândula parótida através do Duto de Stensen. A metodologia descrita oferece orientações que podem ser potencialmente utilizadas por pesquisadores que exploram a utilidade do tecido salivar como local para terapia genética e outras aplicações.
Existem várias etapas críticas para garantir o sucesso do procedimento. Em primeiro lugar, todas as etapas processuais devem ser concluídas suavemente. O forte aumento da boca pode resul...

Embora as glândulas salivares sejam bem conhecidas por sua produção exócrina de saliva, os pesquisadores há muito reconhecem sua capacidade de segregar proteínas diretamente na corrente sanguínea1, tornando-as um alvo potencial para a terapia genética para administração sistêmica, como hormônios de reposição ou produção de anticorpos. De fato, as glândulas salivares oferecem várias vantagens sobre outros alvos teciduais, como a capacidade inerente de produzir proteínas para secreção (falta de músculos de propriedade), encapsulamento pesado que pode limitar a difusão vetorial e tecido bem diferenciado que proporciona estabilidade para vetores não integradores. Além disso, no caso de um evento adverso grave, as glândulas salivares não são críticas para a vida e podem ser removidas cirurgicamente. Embora não seja imediatamente intuitiva, as glândulas parótida também são facilmente acessíveis da boca através de seu principal ducto excretório, o Ducto2de Stensen .
Dadas as vantagens do tecido salivar para a terapia genética, há um interesse crescente em explorar esse alvo tecidual. Inúmeros estudos já foram realizados em modelos de primatas roedores, caninos e não humanos e pelo menos um ensaio clínico humano está em andamento3,4,5. Para explorar e desenvolver ainda mais a utilidade desse alvo tecidual para fins de terapia genética, mais estudos de primatas não humanos precisarão ser realizados. Este artigo descreve um método para acessar as glândulas parótidas através do Ducto de Stensen para fornecer um gene vetorial para transdução no modelo de primata não humano. Para demonstrar visivelmente a entrega do infundido e a anatomia do duto ao entrar na glândula, foi realizada fluoroscopia por radiocontrato. Para demonstrar a transdução bem sucedida de um vetor, foi utilizado um sorotipo Adenovírus 5 (Ad5) vetored gene egfp. O Ad5 é um vetor bem descrito capaz de transduir tecido salivar. Embora seja muito imunogênico para o uso clínico final, um vetor Ad5 foi escolhido para este estudo de demonstração para garantir uma transdução eficiente. Avaliar a produção de Proteína Fluorescente Verde Aprimorada (EGFP) é um método bem descrito para demonstrar transcrição e tradução bem-sucedidas de um gene vetorial após a transdução e foi feito aqui.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

As glândulas salivares são um alvo atraente para a terapia genética com resultados promissores já levando a testes em humanos. Eles são inerentemente capazes de segregar proteínas na corrente sanguínea e são facilmente acessíveis, tornando-os locais de tecido potencialmente superior para a produção de hormônios de reposição ou vacinação por transferência genética. Os métodos sugeridos para a entrega de genes incluem injeção transcutânea e infusão retrógrada através de dutos salivares. Demonstramos como realizar a Infusão de GlândulaS Salivares Retrógradas (RSGI) em primatas não humanos. Descrevemos os importantes marcos anatômicos, incluindo a identificação da papila parótida, um método atrauático de cânulação e vedação do Duto de Stensen utilizando ferramentas básicas dentárias, tubos de polietileno e cianoacrilato, e a taxa apropriada de infusão. Embora este seja o método menos traumático de entrega, o método ainda é limitado pelo volume capaz de ser entregue (<0,5 mL) e o potencial de trauma no duto e na glândula. Demonstramos usando fluoroscopia que um infusor pode ser totalmente entregue na glândula, e demonstramos ainda pela imunohistoquímica a transdução de um vetor típico e expressão do gene entregue.

Procedimento bem sucedido, transdução e transcrição A Figura 1 mostra a papila parótida adjacente ao 2º molar na bochecha superior posterior. A imagem também mostra a colocação correta da cinta bucal, uma extremidade de borracha no paladar duro e a outra ponta de borracha no canino ipsilateral. A Figura 2 mostra uma imagem tirada após a canulação bem sucedida da papila parotíide na marca de 2 cm no PET10. <strong class...

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Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

As glândulas salivares têm sido propostas como um local alvo tecidual para a terapia genética, especialmente na área de vacinação por transferência genética. Demonstramos a entrega de genes em um modelo de primata não humano utilizando infusão parotída retrógrada.

Infusão de glândula parotóide retrógrada através do duto de Stensen em um primata não humano para entrega de genes vetoriados

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Este protocolo é importante porque demonstra o procedimento de infusão de glândula salivar retrógrada em detalhes. O procedimento pode ser usado por uma variedade de razões médicas, como imunoprofilaxia vetorial ou terapia genética. Esta técnica é fácil de aprender e reproduzir.Os autores conseguiram realizar esse procedimento com sucesso em várias ocasiões, apesar de não serem cirurgiões orais, nem terem tal formação. Após anestesiar use lupas dentárias para ampliação e identifique a papila parótida ou a abertura do duto de Stenson na bochecha posterior adjacente ao molar superior segundo. Dilate suavemente a papila parótida colocando o ponto de um dilatador cônico no centro ou abertura da papila e gire o dilatador para frente e para trás por aproximadamente 20 a 30 segundos.Em seguida, o uso de pinças segura a extremidade marcada do tubo de polietileno preso ao infundado contendo seringa a aproximadamente 0,5 centímetros da extremidade distal e insira suavemente a ponta do tubo na papila dilatada. Avance suavemente o tubo por pequenos movimentos rotativos para ajudar os tubos a deslizar, seguido de reajuste da pinça de 0,5 centímetros proximal para a aderência anterior. Repita este processo até que a marca de dois centímetros atinja a papila parótida.Em seguida, para selar a papila parótida e reduzir o derramamento do infundido de volta na cavidade oral, aplique um cianoacrilato na bochecha ao redor da papila e no tubo inserido. Uma vez que o cianoacrilato seca, injete lentamente o infundido ao longo de cinco minutos a uma taxa de 100 microlitres por minuto. Após a infusão estar completa, deixe o tubo no lugar por pelo menos cinco minutos, mantendo assim o duto selado e permitindo que o infusor permaneça na glândula parótida.Por fim, remova o tubo com tração suave e o cianoacrilato se soltará com o tubo. Fluoroscopia usando uma infusão de contraste de rádio demonstrou ramificação da solução através do duto de Stenson e na glândula parótida. A análise química da glândula parótida revelou coloração positiva para EGFP tanto nas células ductal quanto acinar indicando transdução e transcrição bem sucedidas em ambos os tipos de células.O principal desafio neste procedimento é provavelmente introduzir o tubo de polietileno na papila, que deve ser feito muito suavemente e lentamente.

Research

JoVE Journal

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