Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
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Los autores quieren agradecer al Sr. Cagney Gentry su apoyo audiovisual en la filmación del procedimiento. También queremos reconocer al centro médico Hefner VA por su apoyo académico en la búsqueda de este proyecto.

Todos los procedimientos se realizaron en wake Forest School of Medicine Clarkson Campus para estudios en animales. Se consultó al Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) por consideraciones éticas y se sometieron a revisión los detalles de los procedimientos. Wake Forest IACUC aprobó nuestro protocolo de estudio y todos los procedimientos se realizaron bajo el protocolo aprobado por IACUC #A17-147.
1. Preparación del dispositivo de perfusión
<ol><li>Corte el tamaño...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Aquí describimos un protocolo de infusión retrógrada en la glándula parótida a través del conducto de Stensen. La metodología descrita ofrece orientación que potencialmente puede ser utilizada por investigadores que exploran la utilidad del tejido salival como un sitio para la terapia génica y otras aplicaciones.
Hay múltiples pasos críticos para garantizar el éxito del procedimiento. En primer lugar, todos los pasos del procedimiento deben completarse suavemente. El refuerzo contu...

Si bien las glándulas salivales son bien conocidas por su producción exocrina de saliva, los investigadores han reconocido durante mucho tiempo su capacidad para secretar proteínas directamente en el torrente sanguíneo1,lo que las convierte en un objetivo potencial para la terapia génica para la administración sistémica, como las hormonas de reemplazo o la producción de anticuerpos. De hecho, las glándulas salivales ofrecen varias ventajas sobre otros objetivos tisulares, como la capacidad inherente de producir proteínas para la secreción (una propiedad de la que carecen los músculos), la encapsulación pesada que puede limitar la difusión vectorial y el tejido bien diferenciado que proporciona estabilidad para los vectores no integradores. Además, en caso de un evento adverso grave, las glándulas salivales no son críticas para la vida y pueden extirparse quirúrgicamente. Aunque no son inmediatamente intuitivas, las glándulas parótidas también son fácilmente accesibles desde la boca a través de su conducto excretor principal, el conducto2de Stensen.
Dadas las ventajas del tejido salival para la terapia génica, existe un creciente interés en explorar este objetivo tisular. Ya se han realizado numerosos estudios en modelos de roedores, caninos y primates no humanos y al menos un ensayo clínico en humanos está en marcha3,4,5. Para explorar y desarrollar aún más la utilidad de este objetivo tisular con fines de terapia génica, se necesitarán más estudios de primates no humanos. Este artículo describe un método para acceder a las glándulas parótidas a través del conducto de Stensen para entregar un gen vector para la transducción en el modelo de primates no humanos. Para demostrar visiblemente la entrega de la infusión y la anatomía del conducto a medida que ingresa a la glándula, se realizó fluoroscopia con radiocontraste. Para demostrar la transducción exitosa de un vector, se utilizó un gen egfp vectorado por adenovirus serotipo 5 (Ad5). Ad5 es un vector bien descrito capaz de transducir tejido salival. Aunque es demasiado inmunogénico para el uso clínico final, se eligió un vector Ad5 para este estudio de demostración para garantizar una transducción eficiente. La evaluación de la producción mejorada de proteína fluorescente verde (EGFP) es un método bien descrito para demostrar la transcripción y traducción exitosas de un gen vectorado después de la transducción y se realizó aquí.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

Las glándulas salivales son un objetivo tisular atractivo para la terapia génica con resultados prometedores que ya conducen a ensayos en humanos. Son inherentemente capaces de secretar proteínas en el torrente sanguíneo y son fácilmente accesibles, lo que los convierte en sitios de tejido potencialmente superiores para la producción de hormonas de reemplazo o la vacunación por transferencia de genes. Los métodos sugeridos para la administración de genes incluyen la inyección transcutánea y la infusión retrógrada a través de conductos salivales. Demostramos cómo realizar la infusión retrógrada de glándulas salivales (RSGI) en primates no humanos. Describimos los hitos anatómicos importantes, incluida la identificación de la papila parótida, un método atraumático de canulación y sellado del conducto de Stensen que utiliza herramientas dentales básicas, tubos de polietileno y cianoacrilato, y la velocidad adecuada de infusión. Si bien este es el método de parto menos traumático, el método todavía está limitado por el volumen que se puede administrar (<0.5 ml) y el potencial de trauma en el conducto y la glándula. Demostramos mediante fluoroscopia que un infusato se puede administrar completamente en la glándula, y demostramos además por inmunohistoquímica la transducción de un vector típico y la expresión del gen entregado.

Procedimiento, transducción y transcripción exitosos La Figura 1 muestra la papila parótida adyacente al 2º molar en la mejilla superior posterior. La imagen también muestra la colocación correcta del aparato ortopédico bucal, un extremo de goma en el paladar duro y el otro extremo de goma en el canino ipsilateral. La Figura 2 muestra una imagen tomada después de la canulación exitosa de la papila parótida en la marca de ...

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Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Las glándulas salivales se han propuesto como un sitio objetivo tisular para la terapia génica, especialmente en el área de la vacunación por transferencia de genes. Demostramos la entrega de genes en un modelo de primates no humanos utilizando infusión de parótida retrógrada.

Infusión de la glándula parótida retrógrada a través del conducto de Stensen en un primate no humano para la entrega de genes vectores

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Este protocolo es importante porque demuestra el procedimiento de infusión retrógrada de glándulas salivales en detalle. El procedimiento se puede utilizar por una variedad de razones médicas, como la inmunoprofilaxis vectorial o la terapia génica. Esta técnica es fácil de aprender y reproducir.Los autores han logrado realizar este procedimiento con éxito en múltiples ocasiones a pesar de no ser cirujanos orales, ni tener tales antecedentes. Después de la anestesia, use pastillas dentales para la ampliación e identifique la papila parótida o la abertura del conducto de Stenson en la mejilla posterior adyacente al segundo molar superior. Dilate suavemente la papila parótida colocando el punto de un dilatador cónico en el centro o la abertura de la papila y gira el dilatador hacia adelante y hacia atrás durante aproximadamente 20 a 30 segundos.A continuación, con pinzas sostenga el extremo marcado del tubo de polietileno unido a la jeringa que contiene infusato a aproximadamente 0,5 centímetros del extremo distal e inserte suavemente la punta del tubo en la papila dilatada. Avance suavemente el tubo mediante pequeños movimientos giratorios para ayudar a que los tubos se deslicen, seguido de un reajuste de las pinzas 0,5 centímetros proximal al agarre anterior. Repita este proceso hasta que la marca de dos centímetros llegue a la papila parótida.A continuación, para sellar la papila parótida y reducir el derrame de la infusión en la cavidad oral, aplique un cianoacrilato en la mejilla alrededor de la papila y en el tubo insertado. Una vez que el cianoacrilato se seque, inyecte lentamente la infusión durante cinco minutos a una velocidad de 100 microlitros por minuto. Después de que se complete la infusión, deje el tubo en su lugar durante al menos cinco minutos, manteniendo así el conducto sellado y permitiendo que la infusión permanezca en la glándula parótida.Finalmente, retire el tubo con una tracción suave y el cianoacrilato se liberará con el tubo. La fluoroscopia mediante una infusión de radioconta contraste demostró la ramificación de la solución a través del conducto de Stenson y hacia la glándula parótida. Inmuno como el análisis químico de la glándula parótida reveló una tinción positiva para EGFP en las células ductal y acinar, lo que indica una transducción y transcripción exitosas en ambos tipos de células.El principal desafío en este procedimiento es probablemente introducir el tubo de polietileno en la papila, lo que debe hacerse muy suave y lentamente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

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that ...

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A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

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Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Las transcripciones específicas de formalina parafina fijo Embedded pulmón granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...