Name: retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Författarna vill tacka Cagney Gentry för hans audiovisuella stöd för att filma förfarandet. Vi vill också uppmärksamma Hefner VA medical center för akademiskt stöd i jakten på detta projekt.

Alla procedurer utfördes på Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus för djurstudier. Den institutionella kommittén för djurs vård och användning (IACUC) rådfrågades av etiska skäl och detaljer om förfarandena lämnades in för granskning. Wake Forest IACUC godkände vårt studieprotokoll och alla procedurer gjordes enligt IACUC-godkända protokoll #A17-147.
1. Förbereda infusionsanordningen
<ol><li>Skär storlek 10 Polyetenrör (PET10) i 25 cm längder med en sax.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands.">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li><li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+epithelial+cells:+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics.">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li><li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys.">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li><li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response.">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).</li><li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction.">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer.">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor/DNA+formulation.">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li><li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection.">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li><li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+salivary+glands:+From+the+bench+to+the+clinic.">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li><li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates.">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li></ol>

Här beskriver vi ett protokoll om bakåtsträvande infusion i parotidkörteln genom Stensens kanal. Den beskrivna metoden ger vägledning som potentiellt kan användas av forskare som utforskar nyttan av salivvävnad som en plats för genterapi och andra applikationer.
Det finns flera kritiska steg för att säkerställa att proceduren blir framgångsrik. Först och främst bör alla förfarandemässiga steg slutföras varsamt. Kraftfull bracing av munnen kan resultera i mandibular subluxatio...

Medan salivkörtlar är kända för sin exokrina produktion av saliv, har forskare länge erkänt sin förmåga att utsöndra proteiner direkt i blodomloppet1, vilket gör dem till ett potentiellt mål för genterapi för systemisk administrering, såsom ersättningshormoner eller antikroppsproduktion. Faktum är att salivkörtlar erbjuder flera fördelar jämfört med andra vävnadsmål, såsom den inneboende förmågan att producera proteiner för utsöndring (en egenskapsmuskler saknar), tung inkapsling som kan begränsa vektorspridning och väl differentierad vävnad som ger stabilitet för icke-integrerande vektorer. Dessutom, i händelse av en allvarlig biverkning, salivkörtlar är inte kritiska för livet och kan kirurgiskt avlägsnas. Även om de inte är omedelbart intuitiva, är parotidkörtlar också lättillgängliga från munnen genom deras huvudsakliga utsöndringskanal, Stensens kanal2.
Med tanke på fördelarna med salivvävnad för genterapi ökar intresset för att utforska detta vävnadsmål. Många studier har redan utförts på gnagare, hund och icke-mänskliga primatmodeller och minst en mänsklig klinisk prövning pågår3,4,5. För att ytterligare utforska och utveckla nyttan av detta vävnadsmål för genterapiändamål måste fler icke-mänskliga primatstudier utföras. Detta dokument beskriver en metod för att komma åt parotidkörtlarna genom Stensens kanal för att leverera en vektorerad gen för transduktion i den icke-mänskliga primatmodellen. För att synligt visa leveransen av infusate och anatomin av kanalen när den kommer in i körteln, fluoroskopi med hjälp av radiocontrast utfördes. För att visa framgångsrik transduktion av en vektor användes en Adenovirus serotyp 5 (Ad5) vektored egfp gen. Ad5 är en välbeskriven vektor som kan omvandla salivvävnad. Även om det är för immunogent för ultimat klinisk användning, valdes en Ad5 vektor för denna demonstrationsstudie för att säkerställa effektiv transduktion. Att utvärdera förbättrad grön fluorescerande protein (EGFP) produktion är en väl beskriven metod för att visa framgångsrik transkription och översättning av en vektor gen efter transduktion och gjordes här.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;L U100 syringes with 30-gauge needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328466</td>
			<td>fixed needle for less waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 869-6061</td>
			<td>Atropine inj. 0.54 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (medical glue)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Dermabond topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental loops with light</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B012M3IV80</td>
			<td>Used to enhance visualization of Stensen&#39;s duct papilla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infant Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrimal Dilator</td>
			<td>Surgipro</td>
			<td>SPOI-132</td>
			<td>Used to dialate the Stensen&#39;s duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam injectable solution</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07 890-6698</td>
			<td>Midazolam inj. 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of scissors</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to cut PET10 tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (PE-10)</td>
			<td>Scientific Comodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to spread cyanoacrylate on the cheek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td>low density polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Mouth Opener</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>B01F3LVJXC</td>
			<td>Used to keep the animal&#39;s mouth open.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Amazon (DDP)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to insert PET10 tube into Stenson&#39;s duct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7646-86-7</td>
			<td>Included in plasmid DNA infusates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde parotid gland infusion through stensen's duct in a non-human primate for vectored gene delivery

Salivkörtlar är ett attraktivt vävnadsmål för genterapi med lovande resultat som redan leder till mänskliga prövningar. De är i sig kapabla att utsöndra proteiner i blodomloppet och är lättillgängliga, vilket gör dem potentiellt överlägsna vävnadsplatser för substitutionshormonproduktion eller vaccination genom genöverföring. Föreslagna metoder för gen leverans inkluderar transkutan injektion och bakåtsträvande infusion genom salivary kanaler. Vi visar hur man utför retrograd salivary gland infusion (RSGI) i icke-mänskliga primater. Vi beskriver de viktiga anatomiska landmärken inklusive identifiering av parotid papilla, en atraumatic metod för cannulating och tätning Stensens kanal med hjälp av grundläggande tandverktyg, polyeten slangar och cyanoakrylat och lämplig infusionshastighet. Även om detta är den minst traumatiska leveransmetoden, är metoden fortfarande begränsad av volymen som kan levereras (<0,5 ml) och risken för trauma till kanalen och körteln. Vi visar med fluoroskopi att en infusat kan levereras helt i körteln, och ytterligare visa genom immunohistokemi transduktion av en typisk vektor och uttryck av den levererade genen.

Lyckad procedur, transduktion och transkription Bild 1 visar parotid papilla intill2: a molaren på den bakre överlägsna kinden. Bilden visar också rätt placering av munstödet, en gummislut på den hårda gommen och den andra gummi änden på den ensidiga hunden. Figur 2 visar en bild tagen efter lyckad kannulering av parotidpapillan vid 2 cm-märket på PET10. Figur 3 visar en fluoroskopibild i e...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery at JoVE.com

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Salivkörtlar har föreslagits som en vävnad mål plats för genterapi, särskilt inom området vaccination genom genöverföring. Vi visar gen leverans i en icke-mänskliga primat modell med retrograd parotid infusion.

Retrograd parotidkörtelinfusion genom Stensens kanal i en icke-mänsklig primat för vektor genleverans

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det visar förfarandet för bakåtsträvande salivkörteln infusion i detalj. Förfarandet kan användas av olika medicinska skäl, såsom vektorerad immunprofylax eller genterapi. Denna teknik är lätt att lära sig och reproducera.Författarna har lyckats utföra denna procedur framgångsrikt vid flera tillfällen trots att de inte är muntliga kirurger, eller har någon sådan bakgrund. Efter bedövning använd tandsnull för förstoring och identifiera parotidpapeilla eller öppnandet av Stensons kanal på den bakre kinden intill den övre sekunden molar. Vidga parotidpapeillan försiktigt genom att placera punkten för en konisk dilatator i mitten eller öppningen av papillan och rotera dilatatorn fram och tillbaka i cirka 20 till 30 sekunder.Därefter håller du den markerade änden av polyetenröret som är fäst vid infusatet som innehåller sprutan cirka 0,5 centimeter från den distala änden och för försiktigt in spetsen på röret i den dilaterade papillan. För försiktigt röret framåt genom små roterande rörelser för att hjälpa rören att glida, följt av justering av pincetterna 0,5 centimeter proximalt till föregående grepp. Upprepa denna process tills två centimetermärket når parotidpacilen.För det andra, för att försegla parotidpavillan och minska spillet av infusate tillbaka i munhålan, applicera en cyanoakrylat på kinden runt papilla och på det insatta röret. När cyanoakrylaten torkar, injicera långsamt infusatet över fem minuter med en hastighet av 100 mikroliter per minut. När infusionen är klar, lämna röret på plats i minst fem minuter och håll därmed kanalen förseglad och låt infusatet förbli i parotidkörteln.Slutligen ta bort röret med mild dragkraft så kommer cyanoakrylaten att dra sig loss med röret. Fluoroskopi med hjälp av en radiokontrastinfusion visade förgrening av lösningen genom Stensons kanal och in i parotidkörteln. Immun som den kemiska analysen av parotid körtel visade positiva färgning för EGFP i både duktal och acinar celler som anger framgångsrika transduktion och transkription i båda celltyperna.Den största utmaningen i detta förfarande är förmodligen att införa polyetenröret i papillan, vilket bör göras mycket försiktigt och långsamt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generering av Multivirus-specifika T-celler för att förhindra / behandla virusinfektioner efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Erkännande av Epidermal transglutaminas av IgA och Tissue transglutaminas 2 antikroppar i ett enstaka fall av Rhesus Dermatit

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Utfodring av fästingar på djur för Transmission och Xenodiagnosis i Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Ett restriktionsenzym Based Kloning metod för att bedöma<em&gt; In vitro</em&gt; Replikering Kapacitet på HIV-1 subtyp C Gag-MJ4 Chimära virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection förhållningssätt till Återställa<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Särskilda Avskrifter från formalinfixerad paraffininbäddade Lung Granulom

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Den kröslymfknutor Duct kanylerad Rat Model: Ansökan om bedömning av Intestinal Lymfatisk Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Använda Antigen Capsid-inkorporering strategi för utveckling av adenovirus serotyp 5-vektor Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...