Mikrober, der er vært forbundet udgør dette meget komplekse økosystem, der virkelig kræver billeddannelse, der skal forstås. Og gennem denne partikel, vil vi vise dig, hvordan du går gennem farvning proces og opnå visualisering af værten mikrobiom interface. Forståelse af biologien af værtsrelaterede bakterier kræver en forståelse af deres lokalisering inden for mikromiljøer.

Og denne teknik vil gøre det muligt for os at visualisere individuelle taxa inden for værtsmiljøer, såvel som inden for rammerne af andre bakterier. Gennem denne teknik, Det vil være muligt at afgøre, hvilke bakterier kan have trængt gennem værtsvævet, samt at afgøre, om centrale funktioner såsom værten slim kan være udtømt. Forbered frisk methacarn i en kompatibel beholder med 60% absolut methanol, 30% chloroform og 10% glacial eddikesyre.

Ved hjælp af skarpe og rene værktøjer skæres tarmsegmenter fra musene til billeddannelse. Minimer forstyrre prøven så meget som muligt og håndtere sektionerne ved deres kamme for at undgå at påvirke billeddannelsesområdet. Fastgør prøven så hurtigt som muligt efter dissektionen for at forhindre nedbrydning.

Placer tarmsektionerne i histologikassetter ved forsigtigt at holde en kant af vævet med pincet. Luk kassetten og helt nedsænke den i frisk methacarnopløsning, så opløsningen ikke er ældre end et par timer ved nedsænkning af kassetterne. For kliniske prøver, der vil blive indsamlet i en klinisk suite uden adgang til en røghætte, skal du bruge en polyethylen opbevaring beholder med en flap skåret i låget, der vil tillade passage af histologi kassetter.

Tape denne flap lukket, når der ikke passerer prøver for at forhindre udslip af giftige dampe. Placer paraffin i en varmebestandig beholder og smelt i en ovn ved 60 grader Celsius natten over. Vask vævet ved at hælde væsken ud i den relevante affaldsbeholder og inkubere det sekventielt i absolut methanol, absolut ethanol og xylen som beskrevet i tekstmanuskriptet.

Åbn kassetterne lidt for at gøre det muligt for paraffin at komme ind uden at miste vævssegmenterne ved hjælp af dobbelthandsker eller pincet. Dyk ned og luk kassetterne i beholderen med smeltet paraffin. Placer beholderen tilbage i 60 grader Celsius ovnen, hvilket sikrer, at kassetterne er fyldt med paraffin og ingen store luftbobler tilbage.

Efter inkubation i to timer fjernes beholderen fra ovnen. Brug sammentak, fjern forsigtigt kassetterne. Varm ovnen til 60 grader Celsius og førkrig en Coplin krukke.

Tilsæt nok volumen af xylen i en glasflaske til at dække glasrutschebanerne i krukken to gange og læg parafilm rundt om låget for at forhindre fordampning af xylenerne. Lad temperaturen af xylenerne nå 60 grader Celsius. Forbered FISH hybridiseringsløsningen som nævnt i tekstmanuskriptet.

Placer diasene i Coplin-krukken, så sektionerne ikke kom i kontakt med andre dias eller krukken og bag diasene ved 60 grader Celsius i 10 minutter. Fyld Coplin-krukken med forvarmede xylener fra ovnen i røghætten, og pas på ikke at hælde direkte oven på prøverne og potentielt løsne vævene. Placer Coplin-krukken tilbage i 60 graders ovnen.

Hæld brugte xylener i en ordentlig affaldsbeholder, pas på ikke at forstyrre vævssektionerne på glasrutschebanerne og brug et par sammenkr vil være med til at forhindre, at lysbillederne falder ud af Coplin-krukken. Genopfyld Coplin-krukken med de resterende xylener, og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur i røghætten. Inkuber sektionerne i 99,5% ethanol i fem minutter ved stuetemperatur.

Efter inkubation fjernes diasene fra Coplin-krukken. Tør bagsiden af diasene på et laboratoriestørklæde eller et køkkenrulle og kortvarigt lufttørre, indtil ethanoldråberne er væk. Opret meget tætte cirkler omkring hver vævssektion ved hjælp af en flydende blocker eller PAP-pen for at begrænse det udvidelsesområde, der skulle dækkes af hybridiseringsopløsningen, så du undgår blækkontakt med sektionen.

Forbered hybridiseringsopløsningen, og tilsæt 0,5 mikrogram sonde for hver 50 mikroliter af den anvendte opløsning. Pipette opløsningen på sektionerne på diaset. Overlejre sektionen med fleksible plastdæksler, hvilket sikrer, at mængden af væske, der anvendes, dækker hele sektionen.

Opret et fugtigt kammer med en pipette tip boks med klude eller papirhåndklæder, der er blevet gennemblødt med overskydende hybridisering løsning eller PBS at give fugtighed. Inkuber diaset i det fugtige kammer ved 45 til 50 grader Celsius i mindst tre timer afhængigt af sonden indstillet til at reducere fordampning. Fjern plastdækslerne, og inkuber rutsjebanerne i FISH-vaskebufferen i en Coplin-krukke, der begge er forvarmet til 50 grader Celsius.

Placer Coplin krukken tilbage i 50 grader Celsius ovnen i 10 til 20 minutter. Fjern FISH vaskebufferen, og udskift den med PBS i Coplin-krukken. Umiddelbart efter genopfyldning af Coplin-krukken med PBS skal PBS dekanteres.

Fjern dias fra krukken og pipette counterstain på toppen af hele afsnittet, samtidig med at sørg for ikke at røre vævet med pipettespidsen. Inkuber ved fire grader Celsius i 45 minutter. Vask pletterne tre gange hurtigt med frisk PBS.

Tør bagsiden af diasene mod en klud eller køkkenrulle og lad de fleste af PBS fordampe de sektioner hjulpet af en vakuum linje tilsluttet en pipette spids. Monter sektionerne ved hjælp af et monteringsmedium. Fastgør omslagene på diaset ved at male langs kanterne af dækslet med klar neglelak, idet du sørger for at holde sig væk fra kanten af diaset.

Lad den sætte ved stuetemperatur. Billeder af distale musekoloni mono-koloniseret med Muribaculum intestinale og den ene bi-koloniseret med Muribaculum intestinale og Bacteroides thetaiotaomicron er vist her. Prøverne blev farves med en FISK sonde tre prime cyanin-3 mærket specifikke for Muribaculum isolere og også counter farves med rhodamin-bundet lectin UEA-1 og DAPI.

Billederne af sektioner farves med cyanin-3 FISK, DAPI, og kombineret cyanin-3 FISK og DAPI kanaler viser lokalisering af Muribaculum intestinale. Alle bakterieformede og bakterier mellemstore DAPI signaler er mærket med cyanin-3 i mono-kolonisering tilstand. I bi-kolonisering tilstand, ud over disse cyanin-3 og DAPI dobbelt positive celler, der er DAPI-farvede bakterieceller, der er cyanin-3 negative som forventet.

Med undtagelse af længere filamentøse bakterier er større DAPI-positive strukturer plantemateriale eller kerner fra værtsceller. Et tarmsegment, der er blevet opdelt i en dybde, der giver et overblik over lumen samt langsgående udsigt over epitelet og et lavt sektionssegment, der kun afslører tværsnit af krypter og ingen konstant slimlag eller bakterier, beviser, at overfladiske sektioner ikke vil give lysende skiver af tarmen. Ujævnt væv eller coverlip dækning resulterer i sløret og ujævnt belyst flise scanninger.

Et eksempel på normal baggrund og høj baggrund er også vist her. Som vi lærer mere om mikrobiota, er det blevet virkelig indlysende, at bulk assays såsom sekventering er ikke nok til virkelig at afgøre, hvad der sker mellem forskellige mikrobielle arter, og hvordan de interagerer sammen. Og for dette, vi virkelig har brug for billeddannelse.

Denne type teknik har tilladt nogle virkelig vigtige opdagelser, for eksempel, at afsavn af fiber fra kosten forårsager udtynding af slimlaget og potentielt infektion med patogener som undersøgelser fra Martins-gruppen samt undersøgelser af virkningerne af osmotisk diarré, og hvordan udtømningen af slimlaget virkelig påvirker både værten og mikrobiotaen. Og disse var undersøgelser udført af Sonnenberg-gruppen såvel som vores gruppe.

Summary

Explore More Videos

Immunologi og infektion

udgave 173