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July 9th, 2021
DOI :
July 9th, 2021
•0:04
Introduction
0:56
Tissue Sample Collection and Fixation
2:04
Paraffin Infiltration and Embedding
2:59
Preparation of Slides for Staining and Host Features
4:31
Bacterial Staining with FISH
6:41
Results: Analysis of the Localization of Muribaculum intestinale Relative to Mucus in a Gnotobiotic Mouse Model and Some Common Imaging Problems
8:33
Conclusion
Transcript
सूक्ष्मजीव जो मेजबान से जुड़े होते हैं, इस बहुत ही जटिल पारिस्थितिकी तंत्र को बनाते हैं जिन्हें वास्तव में इमेजिंग को समझने की आवश्यकता होती है। और इस कण के माध्यम से, हम आपको दिखाने जा रहे हैं कि धुंधला प्रक्रिया के माध्यम से कैसे जाना है और मेजबान माइक्रोबायोम इंटरफ़ेस का विज़ुअलाइज़ेशन प्राप्त करना है। मेजबान से जुड़े बैक्टीरिया के जीव विज्ञान को समझने के लिए सूक्ष्म वातावरण के भीतर उनके स्थानीयकरण की समझ की आवश्यकता होती है।
और यह तकनीक हमें मेजबान वातावरण के भीतर व्यक्तिगत टैक्सा की कल्पना करने में सक्षम बनाएगी, साथ ही साथ अन्य बैक्टीरिया के संदर्भ में भी। इस तकनीक के माध्यम से, यह निर्धारित करना संभव होने जा रहा है कि कौन से बैक्टीरिया मेजबान ऊतक के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं, साथ ही यह निर्धारित करने के लिए कि मेजबान बलगम जैसी प्रमुख विशेषताएं समाप्त हो सकती हैं या नहीं। 60% निरपेक्ष मेथनॉल, 30% क्लोरोफॉर्म और 10% ग्लेशियल एसिटिक एसिड के साथ एक संगत कंटेनर में ताजा मेथाकार्न तैयार करें।
तेज और साफ उपकरणों का उपयोग करके, इमेजिंग के लिए चूहों से आंतों के खंडों को काटें। जितना संभव हो सके नमूने को परेशान करना कम करें और इमेजिंग क्षेत्र को प्रभावित करने से बचने के लिए उनकी लकीरों द्वारा वर्गों को संभालें। गिरावट को रोकने के लिए विच्छेदन के बाद जितनी जल्दी हो सके नमूने को ठीक करें।
चिमटी के साथ ऊतक के एक किनारे को नाजुक रूप से पकड़कर आंतों के वर्गों को हिस्टोलॉजी कैसेट में रखें। कैसेट को बंद करें और इसे पूरी तरह से ताजा मेथाकार्न समाधान में डुबो दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि समाधान कैसेट के विसर्जन पर कुछ घंटों से अधिक पुराना नहीं है। नैदानिक नमूनों के लिए जो एक धुएं के हुड तक पहुंच के बिना एक नैदानिक सूट में एकत्र किए जाएंगे, ढक्कन में एक फ्लैप कट के साथ एक पॉलीथीन भंडारण कंटेनर का उपयोग करें जो हिस्टोलॉजी कैसेट के पारित होने की अनुमति देगा।
टेप इस प्रालंब बंद जब विषाक्त धुएं के भागने को रोकने के लिए नमूनों को पारित नहीं कर रहा है. पैराफिन को गर्मी प्रतिरोधी कंटेनर में रखें और रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में पिघल जाएं। उपयुक्त अपशिष्ट रिसेप्टैकल में तरल को डालकर ऊतक को धोएं और इसे पूर्ण मेथनॉल, पूर्ण इथेनॉल और जाइलीन में क्रमिक रूप से इनक्यूबेट करें जैसा कि पाठ पांडुलिपि में वर्णित है।
डबल दस्ताने या चिमटी का उपयोग करके ऊतक खंडों को खोने के बिना पैराफिन को प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए कैसेट को थोड़ा खोलें। जलमग्न और पिघल पैराफिन के कंटेनर में कैसेट बंद. कंटेनर को 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में वापस रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कैसेट पैराफिन से भरे हुए हैं और कोई बड़ा हवा का बुलबुले नहीं रहता है।
दो घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद, कंटेनर को ओवन से हटा दें। संदंश का उपयोग करते हुए, कैसेट को सावधानीपूर्वक हटा दें। ओवन को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और कोप्लिन जार को प्रीवार्म करें।
जार में कांच की स्लाइड को दो बार कवर करने के लिए एक कांच की बोतल में जाइलीन की पर्याप्त मात्रा जोड़ें और जाइलीन के वाष्पीकरण को रोकने के लिए ढक्कन के चारों ओर पैराफिल्म रखें। जाइलीन का तापमान 60 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने दें। मछली संकरण समाधान तैयार के रूप में पाठ पांडुलिपि में उल्लेख किया गया है.
स्लाइड्स को कोप्लिन जार में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि अनुभाग अन्य स्लाइड या जार के संपर्क में नहीं आए और स्लाइड को 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें। धुएं के हुड में, ओवन से prewarmed xylenes के साथ Coplin जार भरें, ध्यान रखें कि नमूनों के शीर्ष पर सीधे न डालें और संभावित रूप से ऊतकों को हटा दें। कोप्लिन जार को 60 डिग्री ओवन में वापस रखें।
एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में इस्तेमाल किया xylenes डालो, ध्यान रखने के लिए कांच स्लाइड पर ऊतक वर्गों को परेशान नहीं है और कोप्लिन जार से बाहर गिरने से स्लाइड रखने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर. शेष xylenes के साथ Coplin जार को फिर से भरें और धुएं हुड में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 99.5% इथेनॉल में वर्गों को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन बाद, Coplin जार से स्लाइड्स निकालें। एक प्रयोगशाला पोंछे या एक कागज तौलिया पर स्लाइड के पीछे पोंछें और संक्षेप में हवा सूखी जब तक इथेनॉल बूंदों चले जाते हैं. संकरण समाधान द्वारा कवर किए जाने के लिए आवश्यक विस्तार के क्षेत्र को सीमित करने के लिए एक तरल ब्लॉकर या पीएपी पेन का उपयोग करके प्रत्येक ऊतक अनुभाग के चारों ओर बहुत करीबी सर्कल बनाएं, अनुभाग के साथ स्याही संपर्क से बचें।
संकरण समाधान तैयार करें और उपयोग किए गए समाधान के प्रत्येक 50 माइक्रोलीटर के लिए 0.5 माइक्रोग्राम जांच जोड़ें। स्लाइड पर अनुभागों पर समाधान pipette. लचीले प्लास्टिक coverslips के साथ अनुभाग ओवरले, यह सुनिश्चित करते हुए कि तरल की मात्रा का उपयोग किया पूरे अनुभाग को कवर.
पोंछे या कागज तौलिये है कि अतिरिक्त संकरण समाधान या नमी प्रदान करने के लिए PBS के साथ भिगोया गया है के साथ एक पिपेट टिप बॉक्स के साथ एक आर्द्र कक्ष बनाएँ। वाष्पीकरण को कम करने के लिए निर्धारित जांच के आधार पर कम से कम तीन घंटे के लिए आर्द्र कक्ष में स्लाइड को 45 से 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्लास्टिक coverslips निकालें और एक Coplin जार दोनों 50 डिग्री सेल्सियस करने के लिए prewarmed में मछली धोने बफर में स्लाइड incubate.
कोप्लिन जार को 10 से 20 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस ओवन में वापस रखें। मछली धोने बफर निकालें और Coplin जार में पीबीएस के साथ इसे प्रतिस्थापित करें। पीबीएस के साथ कोप्लिन जार को फिर से भरने के तुरंत बाद, पीबीएस को डिकेंट करें।
जार से स्लाइड निकालें और पूरे अनुभाग के शीर्ष पर काउंटरस्टेन को पिपेट करें, जबकि पिपेट टिप के साथ ऊतक को स्पर्श न करना सुनिश्चित करें। 45 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ताजा पीबीएस के साथ दाग को तीन बार जल्दी से धोएं।
एक पोंछे या कागज तौलिया के खिलाफ स्लाइड के पीछे पोंछें और PBS के अधिकांश एक पिपेट टिप से जुड़े एक वैक्यूम लाइन द्वारा सहायता प्राप्त वर्गों से वाष्पित हो जाने दें। एक बढ़ते माध्यम का उपयोग कर अनुभागों को माउंट करें। स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों के साथ पेंटिंग करके स्लाइड पर कवरलिप्स चिपकाएं, स्लाइड के किनारे से दूर रहने का ख्याल रखें।
इसे कमरे के तापमान पर सेट होने दें। माउस के दूरस्थ बृहदान्त्र की छवियों के साथ मोनो उपनिवेशित Muribaculum आंत्र और एक द्वि-Muribaculum आंत्र और Bacteroides thetaiotaomicron के साथ उपनिवेशित यहाँ दिखाया गया है. नमूनों को एक मछली जांच तीन प्रमुख साइनिन -3 के साथ दाग दिया गया था, जो मुरीबाकुलम आइसोलेट के लिए विशिष्ट टैग किया गया था और रोडामाइन-बाउंड लेक्टिन यूईए -1 और डीएपीआई के साथ भी काउंटरकिया गया था।
साइनिन -3 मछली, DAPI, और संयुक्त साइनिन -3 मछली और DAPI चैनलों के साथ दाग वर्गों की छवियों Muribaculum आंत्र के स्थानीयकरण से पता चलता है. सभी बैक्टीरिया के आकार के और बैक्टीरिया के आकार के डीएपीआई संकेतों को मोनो-उपनिवेशीकरण राज्य में साइनिन -3 के साथ लेबल किया जाता है। द्वि-उपनिवेशीकरण राज्य में, इन साइनिन -3 और डीएपीआई डबल पॉजिटिव कोशिकाओं के अलावा, डीएपीआई-दाग वाले जीवाणु कोशिकाएं हैं जो उम्मीद के अनुसार साइनिन -3 नकारात्मक हैं।
लंबे समय तक फिलामेंटस बैक्टीरिया के अपवाद के साथ, बड़ी डीएपीआई-सकारात्मक संरचनाएं मेजबान कोशिकाओं से पौधे की सामग्री या नाभिक हैं। एक आंतों का खंड जिसे गहराई से विभाजित किया गया है जो लुमेन के साथ-साथ उपकला के अनुदैर्ध्य दृश्यों और एक उथले अनुभाग खंड का दृश्य प्रदान करता है जो केवल क्रिप्ट्स के क्रॉस-सेक्शन का खुलासा करता है और कोई निरंतर बलगम परत या बैक्टीरिया साबित नहीं करता है कि उथले सेक्शनिंग आंत के ल्यूमिनल स्लाइस प्रदान नहीं करेगा। असमान ऊतक या कवरस्लिप कवरेज के परिणामस्वरूप धुंधला और असमान रूप से प्रकाशित टाइल स्कैन होता है।
सामान्य पृष्ठभूमि और उच्च पृष्ठभूमि का एक उदाहरण भी यहां दिखाया गया है। जैसा कि हम माइक्रोबायोटा के बारे में अधिक सीखते हैं, यह वास्तव में स्पष्ट हो गया है कि अनुक्रमण जैसे थोक assays वास्तव में यह निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं कि विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातियों के बीच क्या होता है और वे एक साथ कैसे बातचीत करते हैं। और इसके लिए, हमें वास्तव में इमेजिंग की आवश्यकता होती है।
इस प्रकार की तकनीक ने कुछ वास्तव में महत्वपूर्ण खोजों की अनुमति दी है, उदाहरण के लिए, आहार से फाइबर का अभाव बलगम परत के पतले होने और रोगजनकों द्वारा संभावित संक्रमण का कारण बनता है जैसे कि मार्टिन्स समूह के अध्ययन, साथ ही साथ आसमाटिक दस्त के प्रभावों में अध्ययन और बलगम परत की कमी वास्तव में मेजबान और माइक्रोबायोटा दोनों को कैसे प्रभावित करती है। और ये Sonnenberg समूह, साथ ही साथ हमारे समूह द्वारा किए गए अध्ययन थे।
यह सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल जटिल ऊतक नमूनों में बैक्टीरिया का पता लगाने और छवि बनाने के लिए एक वर्कफ़्लो का विवरण देता है, ऊतक को ठीक करने से लेकर सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट के साथ रोगाणुओं को धुंधला करने तक।
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