6.4K Views
•
09:31 min
•
July 9th, 2021
DOI :
July 9th, 2021
•0:04
Introduction
0:56
Tissue Sample Collection and Fixation
2:04
Paraffin Infiltration and Embedding
2:59
Preparation of Slides for Staining and Host Features
4:31
Bacterial Staining with FISH
6:41
Results: Analysis of the Localization of Muribaculum intestinale Relative to Mucus in a Gnotobiotic Mouse Model and Some Common Imaging Problems
8:33
Conclusion
Transcript
Mikrober som er vert assosiert utgjør dette svært komplekse økosystemet som virkelig krever at avbildning skal forstås. Og gjennom denne partikkelen skal vi vise deg hvordan du går gjennom fargingsprosessen og oppnår visualisering av vertsmikrobiomegrensesnittet. Å forstå biologien til vertsrelaterte bakterier krever forståelse av deres lokalisering innen mikromiljøer.
Og denne teknikken vil gjøre oss i stand til å visualisere individuell taxa i vertsmiljøer, så vel som innenfor konteksten av andre bakterier. Gjennom denne teknikken vil det være mulig å avgjøre hvilke bakterier som kan ha penetrert gjennom vertsvevet, samt å avgjøre om viktige funksjoner som vertsslimet kan være utarmet. Forbered fersk methacarn i en kompatibel beholder med 60% absolutt metanol, 30% kloroform og 10% issyre.
Bruk skarpe og rene verktøy, kutt tarmsegmenter fra musene for avbildning. Minimer forstyrre prøven så mye som mulig og håndter seksjonene ved ryggene for å unngå å påvirke bildeområdet. Reparer prøven så snart som mulig etter avhandlingen for å forhindre nedbrytning.
Plasser tarmseksjonene i histologikassetter ved å holde en kant av vevet delikat med pinsett. Lukk kassetten og senk den helt ned i fersk methacarn-løsning, og sørg for at løsningen ikke er eldre enn noen få timer ved nedsenking av kassettene. For kliniske prøver som vil bli samlet inn i en klinisk suite uten tilgang til en avtrekkshette, bruk en polyetylenlagringsbeholder med en klaff kuttet i lokket som vil tillate passasje av histologikassettene.
Tape denne klaffen lukket når du ikke passerer prøver for å forhindre rømming av giftige røyk. Legg parafinen i en varmebestandig beholder og smelt i en ovn ved 60 grader Celsius over natten. Vask vevet ved å helle ut væsken i riktig avfallsbeholder og inkubere den sekvensielt i absolutt metanol, absolutt etanol og xylen som beskrevet i tekstmanuskriptet.
Åpne kassettene litt slik at parafinen kommer inn uten å miste vevssegmentene ved hjelp av doble hansker eller pinsett. Senk og lukk kassettene i beholderen med smeltet paraffin. Plasser beholderen tilbake i 60 grader Celsius-ovnen, og sørg for at kassettene er fylt med parafin og ingen store luftbobler gjenstår.
Etter inkubasjon i to timer, fjern beholderen fra ovnen. Bruk tang, fjern kassettene forsiktig. Varm ovnen til 60 grader Celsius og forvarm en Coplin krukke.
Tilsett nok volum xylen i en glassflaske til å dekke glasssklier i krukken to ganger og legg parafilm rundt lokket for å forhindre fordampning av xylenes. La temperaturen på xylenes nå 60 grader Celsius. Forbered FISH hybridiseringsløsningen som nevnt i tekstmanuskriptet.
Plasser lysbildene i Coplin-krukken, sørg for at seksjonene ikke kom i kontakt med andre lysbilder eller krukken og bake lysbildene ved 60 grader Celsius i 10 minutter. I avtrekkshetten fyller du Coplin-krukken med forvarmede xylener fra ovnen, pass på at du ikke heller direkte på toppen av prøvene og potensielt løsner vevet. Sett Coplin-krukken tilbake i 60 graders ovnen.
Hell brukte xylener i en riktig avfallsbeholder, pass på at du ikke forstyrrer vevsdelene på glasssklier og bruker et par tang for å forhindre at lysbildene faller ut av Coplin-krukken. Fyll opp Coplin-krukken med de resterende xylenene og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i avtrekkshetten. Inkuber seksjonene i 99,5% etanol i fem minutter ved romtemperatur.
Etter inkubasjon, fjern lysbildene fra Coplin-krukken. Tørk av baksiden av lysbildene på en laboratorieserviett eller et papirhåndkle og tørk kort til etanoldråpene er borte. Lag svært nære sirkler rundt hver vevsseksjon ved hjelp av en væskeblokkering eller PAP-penn for å begrense ekspansjonsområdet som trengs for å bli dekket av hybridiseringsløsningen, og unngå blekkkontakt med delen.
Forbered hybridiseringsløsningen og tilsett 0,5 mikrogram sonde for hver 50 mikroliter av løsningen som brukes. Pipette løsningen på delene på lysbildet. Overlegg delen med fleksible plastdeksler, og sørg for at volumet av væske som brukes dekker hele delen.
Lag et fuktig kammer med en pipettespissboks med våtservietter eller papirhåndklær som har blitt gjennomvåt med overflødig hybridiseringsløsning eller PBS for å gi fuktighet. Inkuber lysbildet i det fuktige kammeret ved 45 til 50 grader Celsius i minst tre timer, avhengig av sonden som er satt til å redusere fordampning. Fjern plastdekslene og inkuber lysbildene i FISH vaskebuffer i en Coplin krukke begge forvarsel til 50 grader Celsius.
Sett Coplin-krukken tilbake i 50 grader Celsius-ovnen i 10 til 20 minutter. Fjern FISH-vaskebufferen og erstatt den med PBS i Coplin-krukken. Umiddelbart etter påfylling av Coplin-krukken med PBS, dekanterer du PBS.
Fjern lysbilder fra krukken og pipette tellerne på toppen av hele delen, samtidig som du ikke berører vevet med pipettespissen. Inkuber ved fire grader Celsius i 45 minutter. Vask flekkene tre ganger raskt med fersk PBS.
Tørk av baksiden av lysbildene mot en klut eller et papirhåndkle og la det meste av PBS fordampe av seksjonene som er hjulpet av en vakuumledning koblet til en pipettespiss. Monter seksjonene ved hjelp av et monteringsmedium. Fest dekslene til lysbildet ved å male langs kantene på dekslene med klar neglelakk, pass på å holde seg borte fra kanten av lysbildet.
La den stilles inn ved romtemperatur. Bilder av distal kolon av mus mono-kolonisert med Muribaculum intestinale og den som er bikolonisert med Muribaculum intestinale og Bacteroides thetaiotaomicron er vist her. Prøvene ble farget med en FISH-sonde tre prime cyanin-3 merket spesifikt for Muribaculum isolert og også motarbeidet med rhodaminbundet lectin UEA-1 og DAPI.
Bildene av seksjoner farget med cyanin-3 FISK, DAPI og kombinerte cyanin-3 FISH- og DAPI-kanaler viser lokaliseringen av Muribaculum intestinale. Alle bakterieformede og bakteriestore DAPI-signaler er merket med cyanin-3 i monokoloniseringstilstanden. I bikoloniseringstilstanden, i tillegg til disse cyanin-3 og DAPI doble positive cellene, er det DAPI-fargede bakterieceller som er cyanin-3 negative som forventet.
Med unntak av lengre filamentøse bakterier er større DAPI-positive strukturer plantemateriale eller kjerner fra vertsceller. Et tarmsegment som har blitt seksjonert på en dybde som gir utsikt over lumen samt langsgående utsikt over epitelet og et grunt seksjonssegment som bare avslører tverrsnitt av krypter og ingen konstant slimlag eller bakterier, beviser at grunne seksjoner ikke vil gi lysskiver i tarmen. Ujevnt vev eller deksler gir uklare og ujevnt opplyste flisskanninger.
Et eksempel på normal bakgrunn og høy bakgrunn vises også her. Når vi lærer mer om mikrobiota, har det blitt veldig åpenbart at bulkanalyser som sekvensering ikke er nok til å virkelig bestemme hva som skjer mellom forskjellige mikrobielle arter og hvordan de samhandler sammen. Og for dette krever vi virkelig bildebehandling.
Denne typen teknikk har tillatt noen virkelig viktige funn, for eksempel at deprivasjon av fiber fra dietten forårsaker tynning av slimlaget og potensielt infeksjon av patogener som studier fra Martins-gruppen, samt studier i effekten av osmotisk diaré og hvordan uttømming av slimlaget virkelig påvirker både verten og mikrobiota. Og dette var studier gjort av Sonnenberg-gruppen, så vel som vår gruppe.
Denne strømlinjeformede protokollen beskriver en arbeidsflyt for å oppdage og bildebakterier i komplekse vevsprøver, fra å fikse vevet til farging av mikrober med fluorescerende in situ hybridisering.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved