Name: anterior segment organ culture platform for tracking open globe injuries and therapeutic performance
Uploaded: 2021-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance at JoVE.com

Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom Verteidigungsministerium der Vereinigten Staaten durch eine behördenübergreifende Vereinbarung (#19-1006-IM) mit dem Temporary Corneal Repair Acquisition Program (United States Army Medical Materiel Development Agency) unterstützt werden.

Bevor Sie dieses Protokoll durchführen, beachten Sie, dass es rechtliche und ethische Anforderungen für die Verwendung von Tieren in Forschung und Ausbildung gibt. Wenn lebende Tiere als Quelle von Augengewebe verwendet werden, holen Sie vor Beginn die Genehmigung der örtlichen ethischen oder rechtlichen Behörde (IACUC oder Ethikkommission usw.) ein. Wenn es irgendwelche Fragen bei der Erlangung der Genehmigung für die Verwendung von Tieren gibt, fahren Sie nicht fort. Wir haben zuvor festgestellt und berichtet, das...

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	<li>Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+injury+surveillance+in+the+US+Department+of+Defense,+1996-2005.">Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005.</a> American Journal of Preventive Medicine. 38, 78-85 (2010).</li><li>Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. 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A new method.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).</li><li>Snider, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+stem+cell+delivery+to+the+trabecular+meshwork+using+magnetic+nanoparticles.">Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).</li><li>Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+trabecular+meshwork+physiology:+a+key+to+the+control+of+intraocular+pressure.">Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure.</a> Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).</li><li>Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+porcine+organ-culture+glaucoma+model+mimicking+trabecular+meshwork+damage.">Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 62 (3), 18 (2021).</li><li>Ren, H., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+the+corneal+epithelium.">Apoptosis in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).</li><li>Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. 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L., Papas, E. B., Garrett, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+staining+and+physiological+state+of+corneal+epithelial+cells.">Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).</li><li>Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+fluorescein+staining+of+the+corneal+epithelium:+What+does+it+mean+at+a+cellular+level.">Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).</li><li>Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+intraocular+foreign+body+removal+without+endophthalmitis+during+Operations+Iraqi+Freedom+and+Enduring+Freedom.">Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom.</a> Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).</li><li>Geggel, H. S., Maza, C. 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K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlin+Expression+in+Anterior+Segment+Organ+Culture+Models+after+TGF&#946;2+Treatment.">Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGF&#946;2 Treatment.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).</li><li>Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+iPSC-TM+stimulates+division+of+trabecular+meshwork+cells+in+human+eyes.">Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).</li></ol>

Es gibt kritische Schritte mit der ASOC OG-Verletzungsplattform, die hervorgehoben werden sollten, um die Erfolgswahrscheinlichkeit bei der Verwendung der Methodik zu verbessern. Erstens ist es während der Dissektion des vorderen Segments wichtig, das trabekuläre Geflecht zu erhalten, aber es ist schwierig, es richtig zu machen. Wenn das TM gestört ist, hält das Auge den physiologischen Druck nicht aufrecht und erfüllt nicht die Zulassungskriterien für die experimentelle Verwendung. Es wird empfohlen, den Dissektio...

Open Globe (OG)-Verletzungen können zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führen, wenn sie nach einer Verletzung nicht behandelt oder zumindest stabilisiert werden1. Verzögerungen sind jedoch in abgelegenen Gebieten weit verbreitet, in denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen nicht ohne weiteres möglich ist, wie in ländlichen Gebieten oder auf dem Schlachtfeld in militärischen Szenarien. Wenn die Behandlung nicht ohne weiteres verfügbar ist, besteht der derzeitige Behandlungsstandard darin, das Auge mit einem starren Schild zu schützen, bis ein medizinischer Eingriff möglich ist. In der Militärmedizin beträgt diese Verzögerung derzeit bis zu 24 Stunden, aber es wird erwartet, dass sie in zukünftigen Kampfeinsätzen in städtischen Umgebungen, in denen eine Luftevakuierung nicht möglichist,auf bis zu 72 Stunden ansteigen wird2,3,4. Diese Verzögerungen können in ländlichen, abgelegenen zivilen Anwendungen, bei denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen begrenztist,noch länger sein5,6. Eine unbehandelte OG-Verletzung ist sehr anfällig für Infektionen und Verlust des Augeninnendrucks (IOP), da die wasserdichte Versiegelung des Auges beeinträchtigt ist7,8. Der Verlust des IOD kann die Lebensfähigkeit des Gewebes beeinträchtigen, so dass es unwahrscheinlich ist, dass ein medizinischer Eingriff das Sehvermögen wiederherstellt, wenn die Verzögerung zwischen Verletzung und Therapie zu lang ist9.
Um die Entwicklung einfach anzuwendender Therapeutika zur Abdichtung von OG-Verletzungen zu ermöglichen, bis ein Augenarzt erreicht werden kann, wurde zuvor ein Benchtop-OG-Verletzungsmodell entwickelt10,11. Bei diesem Modell wurden Hochgeschwindigkeitsverletzungen in ganzen Schweineaugen erzeugt, während IOD von Druckaufnehmern erfasst wurde. Therapeutika können dann angewendet werden, um ihre Fähigkeit zu beurteilen, die OG-Verletzungsstelle zu versiegeln12. Da dieses Modell jedoch ganze Schweineaugen verwendet, kann es nur die sofortige therapeutische Leistung beurteilen, ohne dass die längerfristige Leistung über das mögliche 72-Stunden-Fenster verfolgt werden kann, in dem das Therapeutikum die Verletzungsstelle stabilisieren muss, bis der Patient die Spezialbehandlung erreicht. Infolgedessen wurde ein anteriores Segment Organ Culture (ASOC) OG-Verletzungsmodell entwickelt und in diesem Protokoll als Plattform zur Verfolgung der langfristigen therapeutischen Leistungdetailliert beschrieben 13.
ASOC ist eine weit verbreitete Technik zur Aufrechterhaltung von avaskulärem Gewebe des vorderen Segments, wie der Hornhaut, für mehrere Wochen nach der Enukleation14,15,16,17. Das vordere Segment wird unter physiologischem IOD aufrechterhalten, indem Flüssigkeit mit physiologischen Durchflussraten durchschränkt wird und die trabekuläre Netzabflussregion, das Gewebe, das für die Regulierung des IOD verantwortlich ist, während des ASOC-Setups erhalten bleibt18,19. Die ASOC-Plattform kann Gewebe physiologisch erhalten, eine OG-Verletzung mit einem pneumatisch betriebenen Gerät induzieren, ein Therapeutikum anwenden und die Verletzungsstabilisierung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzungverfolgen 13.
Hier bietet das Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Methodik für die Verwendung der ASOC-Plattform. Zuerst wird beschrieben, wie die ASOC-Plattform eingerichtet und hergestellt wird. Als nächstes beschreibt das Protokoll, wie das vordere Segment aseptisch seziert und das trabekuläre Geflecht beibehalten wird, gefolgt von der Einrichtung von vorderem Segmentgewebe in speziell angefertigten Organkulturschalen. Dann wird beschrieben, wie man Open-Globe-Verletzungen erzeugt und therapeutisch unmittelbar nach der Verletzung anwendet. Schließlich bietet das Protokoll einen Überblick über Charakterisierungsparameter, die mit dieser Methode möglich sind, die funktionelle, mechanische und biologische Eigenschaften des Auges bewertet und wie gut die Verletzung stabilisiert wurde. Insgesamt bietet dieses Modell eine dringend benötigte Plattform, um die Produktentwicklung zur Stabilisierung und Behandlung von Open-Globe-Verletzungen zu beschleunigen und die Schlechtesichtprognose nach Verletzungen zu verbessern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-32 Socket cap screw, &#189;&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92196A269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ball-End L key</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5020A25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1696484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Intramedic&#160;PE 160 Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-8061WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233T47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium toothed forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail (puncture object)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>97808A503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate, three-way, stopcock with male&#160;luer&#160;lock</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9593742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 18 G&#160;90 degree&#160;angle dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 18 G straight &#189;&#39;&#8217; dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 100 mL beakers with lids</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15704-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas&#160;scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>WP5070</td>
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anterior segment organ culture platform for tracking open globe injuries and therapeutic performance

Open-Globe-Verletzungen haben schlechte visuelle Ergebnisse, was oft zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führt. Dies ist zum Teil auf eine längere Verzögerung zwischen Verletzungen und medizinischen Eingriffen in ländlichen Umgebungen und militärmedizinischen Anwendungen zurückzuführen, bei denen die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist. Unbehandelte Verletzungen sind anfällig für Infektionen, nachdem das Auge seine wasserdichte Versiegelung verloren hat, sowie verlust der Gewebelebensfähigkeit aufgrund von intraokularer Hypotonie. Therapeutika zur vorübergehenden Abdichtung von Verletzungen mit offenem Globus können, wenn sie richtig entwickelt wurden, den Augeninnendruck wiederherstellen und Infektionen verhindern, bis eine ordnungsgemäße Augenheilkunde möglich ist. Um die Produktentwicklung zu erleichtern, wird hier die Verwendung einer offenen Globus-Verletzungsplattform für die organkulturelle Anterior-Segment zur Verfolgung der therapeutischen Leistung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzung detailliert beschrieben. Porcines vorderes Segmentgewebe kann in speziell angefertigten Organkulturschalen gehalten und bei physiologischem Augeninnendruck gehalten werden. Punktionsverletzungen können mit einem pneumatisch angetriebenen System erzeugt werden, das Verletzungsgrößen von bis zu 4,5 mm Durchmesser erzeugen kann, ähnlich wie militärisch relevante Verletzungsgrößen. Ein Verlust des Augeninnendrucks kann 72 Stunden nach der Verletzung beobachtet werden, was die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion und den Verlust der wasserdichten Augendichtung bestätigt. Die therapeutische Leistung kann durch Anwendung auf das Auge nach Verletzungsinduktion und anschließender Verfolgung des Augeninnendrucks für mehrere Tage verfolgt werden. Darüber hinaus ist das Anterior-Segment-Verletzungsmodell auf weit verbreitete Methoden zur funktionellen und biologischen Verfolgung der Physiologie des vorderen Segments anwendbar, wie z. B. die Beurteilung von Transparenz, Augenmechanik, Hornhautepithelgesundheit und Gewebelebensfähigkeit. Insgesamt ist die hier beschriebene Methode ein notwendiger nächster Schritt zur Entwicklung von Biomaterialtherapeutika zur vorübergehenden Versiegelung von Verletzungen am offenen Globus, wenn die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist.

Bilder, die mittels optischer Kohärenztomographie (OCT) aufgenommen wurden, werden für OG-verletzte Augen gezeigt, um zu veranschaulichen, wie eine erfolgreiche Verletzungsinduktion aussieht. Abbildung 3 zeigt Bilder für Kontroll- und OG-verletztes AS-Gewebe unmittelbar nach der Verletzung und 72 h später. Es werden zwei Ansichten gezeigt: Querschnittsbilder durch die Verletzungsstelle und Top-Down-Projektion mit maximaler Intensität (MIPs), um die Oberfläche des Bildes zu visualisiere...

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Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Open-Globe-Augenverletzungen können in ländlichen oder militärrelevanten Szenarien mehrere Tage unbehandelt bleiben, was zu Blindheit führt. Therapeutika werden benötigt, um den Verlust des Sehvermögens zu minimieren. Hier beschreiben wir ein Organkultur-Open-Globe-Verletzungsmodell. Mit diesem Modell können mögliche Therapeutika zur Stabilisierung dieser Verletzungen richtig bewertet werden.

Anterior Segment Organ Culture Platform zur Verfolgung von Open Globe Verletzungen und therapeutischer Leistung

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

Verletzungen des offenen Globus können zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führen, wenn sie unbehandelt bleiben. Dieses Vordersegment-Organkulturmodell ermöglicht die Beurteilung dieser Verletzungen im Rahmen der Notwendigkeit von Tierversuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Verfolgung von Open-Globe-Verletzungen und Therapeutika, um die Verletzung für drei oder mehr Tage mit einer Organkulturplattform zu stabilisieren.Trent Pearson, ein Forschungstechniker aus dem Dr. Boice-Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Legen Sie zunächst den chirurgischen Vorhang und die Instrumente, die für die grobe Dissektion erforderlich sind. Stellen Sie die Bio-Sicherheitswerkbank auf, um die Augen auf dem Seziermikroskop zu visualisieren.Stellen Sie die Bio-Sicherheitswerkbank für die Schalenmontage ein. Richten Sie den Arbeitsbereich für die Induktion von Verletzungen mit offenem Globus in der Bio-Sicherheitswerkbank ein. Positionieren Sie den Cross-Tracking-Schraubstock auf der Laborbuchse vor der Punktionsplattform.Nach dem Entfernen des zusätzlichen Orbitalgewebes und dem Waschen der Augen mit antibiotischem antimykotischem PBS, um das Auge zu hemisektieren, legen Sie das Auge auf die antibiotische antimykotische PBS-getränkte Gaze. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge oder ein Skalpell, um einen Schnitt in der Nähe des Augenäquators zu erzielen. Dann hemisektieren Sie das Auge mit einer gekrümmten chirurgischen Schere, um das Vorderauge zu isolieren.Verwenden Sie eine Mikroschere als Schaufel, um den Glaskörper aus dem vorderen Segment zu schöpfen und die Linse mit einer Mikroschere aus dem vorderen Segment zu entfernen. Schneiden Sie die Iris allmählich radial zur Iriswurzel, bis das trabekuläre Geflecht sichtbar ist. Verlängern Sie den Schnitt um 360 Grad um die Iris, um den gesamten trabekulären Netzbereich freizulegen und bei Bedarf die verbleibende Irisreste zu reinigen, die das Trabekelgeflecht bedeckt.Schneiden Sie die Ziliarkörperreste hinter dem trabekulären Netzbereich ab und hinterlassen Sie nur ein ein Millimeter dünnes Band des Gewebes. Nach dem Platzieren des vorderen Segments in der Petrischale. Befeuchten Sie einen Wattestäbchen im Medium und tupfen Sie vorsichtig in die Mitte der Hornhaut, um Pigmente zu entfernen.Halten Sie die Augen mit einer Zette und entfernen Sie zusätzliches Pigment um die Sklera durch Abwischen. Legen Sie das umgekehrte vordere Segment über den erhöhten Bereich der unteren Schüssel und stellen Sie sicher, dass die Hornhaut in der Mitte der erhöhten Region bleibt. Positionieren Sie den Klemmring auf dem neu platzierten vorderen Segment und ziehen Sie die Schrauben vorsichtig mit dem L-Schlüssel fest.Befestigen Sie beide fluidischen Anschlüsse mit O-Ringen an Gewindeanschlüssen an der Unterseite der Schüssel. An dem ersten fluidischen Stecker sind 18 Gauge 90 Grad gebogene Nadelnabe, eine Länge des Schlauches, eine 18 Gauge Nadelnabe, ein Nylonspritzenfilter, ein Drei-Wege-Ventil und eine 20 Millimeter Spritze mit Medien gefüllt. An den zweiten fluidischen Stecker befestigen Sie eine 18 Gauge 90 Grad gebogene Nadelnabe, eine Schlauchlänge, eine 18 Gauge Nadelnabe, ein Drei-Wege-Ventil, wie für den ersten Fluid-Stecker demonstriert, und befestigen Sie dann den Fassteil einer sterilen 10-Milliliter-Spritze, die als Reservoir zum Auffangen der Flüssigkeit und der Blasen fungiert.Halten Sie die Dreiwegeventile entsprechend zu den Spritzen geöffnet, drücken Sie das Medium vorsichtig durch das System, indem Sie den ersten Fluidics-Anschluss verwenden. Um das vordere Segment aufzublasen, füllen Sie den Schlauch mit Medien und füllen Sie schließlich das Reservoir. Entfernen Sie die Blasen, indem Sie das Medium vorsichtig in die Schüssel drücken und die Schüssel umkehren, um die Blasen herauszudrücken.Legen Sie die vordere Organkulturschale in den Zellkulturinkubator. Richten Sie die Schlauchleitungen durch die Unterseite der Inkubatortür aus, um Störungen beim Öffnen und Schließen der Tür zu vermeiden. Positionieren Sie die Schlauchleitungen mit dem Reservoir am Druckaufnehmerinstrument.Schließen Sie das seitliche Dreiwegeventil an den Druckaufnehmer an, während PBS durch die Leitung fließt, um zu verhindern, dass die Luftblasen in die Schlauchleitungen gelangen. Im Inneren der vorbereiteten Bio-Sicherheitswerkbank für die offene Verletzungsinduktion stellte der Druckregler auf der Punktionsplattform auf 50 Pfund Kraft pro Quadratzoll ein, um eine ausreichende Durchstichkraft auf die Objekte mit einem Durchmesser von bis zu 4,5 Millimetern zu erzeugen. Positionieren Sie den Kreuzverfolgungsschraubstock auf der Laborbuchse vor der Punktionsplattform.Verlängern Sie den Kolbenarm auf seinen maximalen Abstand und positionieren Sie die Hornhautspitze innerhalb des ein Millimeter großen Bereichs des Punktionsobjekts, ziehen Sie den Kolbenarm ein und bringen Sie das vordere Segment einen Zentimeter näher an das Punktionsobjekt heran. Um die Einstichvorrichtung zu starten, schalten Sie das Gerät ein und öffnen Sie das Magnetventil mit dem zweiten Schalter am Gerät. Um das Gerät vom Auge zurückzuziehen, drücken Sie den zweiten Schalter, überprüfen Sie die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion durch visuelle Inspektion und Medienlecks von der Verletzungsstelle.Nach der Operation wurde die Integrität des Hornhautepithels mittels bildgebender Anwendung mittels optischer Kohärenztomographie beurteilt. Das verletzte vordere Segmentgewebe wurde unmittelbar nach der Verletzung und 72 Stunden nach der Verletzung abgebildet. Die kontrollierten Augen zeigen keine merkliche Störung in der Hornhaut, während nach der Verletzung klare Verletzungen durch die Hornhaut lokalisiert wurden.Aus der Top-Down-Projektion der maximalen Intensität war ersichtlich, dass Verletzungen in Form und Größe unregelmäßig waren, aber die Verletzungsgröße wurde über 72 Stunden verringert. Der Augeninnendruck wurde in den ersten drei Tagen vor der Operation beobachtet, um die Druckstabilität im akzeptablen Bereich zu bestimmen. In den repräsentativen Ergebnissen liegen drei von fünf Augen innerhalb des akzeptablen Augendruckbereichs.Der Augeninnendruck ändert sich aufgrund der Open-Globe-Verletzung und der therapeutischen Intervention. Nach der Induktion der Open-Globe-Verletzung nahm der Druck signifikant ab und blieb niedrig, bis das Experiment abgeschlossen war. Die Behandlung der verletzten Gewebe mit Dermabond-Klebstoff führte zu einem erhöhten Augeninnendruck im Vergleich zu unbehandeltem Gewebe, was darauf hindeutet, dass diese Methode verwendet werden kann, um die Wirksamkeit der Therapeutika zur Wiederherstellung des Augeninnendrucks zu messen.Der anfängliche Aufbau des Segments in der Organkultur ist entscheidend für die Langzeitstabilität des Gewebes. Ein übermäßiges Anziehen des Rings kann zu einer Belastung des Gewebes führen und die Compliance verringern.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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