Name: anterior segment organ culture platform for tracking open globe injuries and therapeutic performance
Uploaded: 2021-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance at JoVE.com

Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti attraverso un accordo interagenzia (# 19-1006-IM) con il programma di acquisizione temporary corneal repair (United States Army Medical Materiel Development Agency).

Prima di eseguire questo protocollo, essere consapevoli del fatto che esistono requisiti legali ed etici per l'uso degli animali nella ricerca e nella formazione. Se gli animali vivi vengono utilizzati per la fonte di tessuto oculare, chiedere l'approvazione dell'autorità etica o legale locale (IACUC o comitato etico, ecc.) prima di iniziare. Se c'è qualche dubbio nell'ottenere l'approvazione per l'uso di animali, non procedere. In precedenza abbiamo determinato e riportato che gli occhi suini freschi ottenuti e utiliz...

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	<li>Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+injury+surveillance+in+the+US+Department+of+Defense,+1996-2005.">Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005.</a> American Journal of Preventive Medicine. 38, 78-85 (2010).</li><li>Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. 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K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlin+Expression+in+Anterior+Segment+Organ+Culture+Models+after+TGF&#946;2+Treatment.">Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGF&#946;2 Treatment.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).</li><li>Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+iPSC-TM+stimulates+division+of+trabecular+meshwork+cells+in+human+eyes.">Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).</li></ol>

Ci sono passaggi critici con la piattaforma di lesioni ASOC OG che dovrebbero essere evidenziati per migliorare la probabilità di successo quando si utilizza la metodologia. In primo luogo, durante la dissezione del segmento anteriore, preservare la rete trabecolare è essenziale ma difficile da fare correttamente. Se la Meditazione Trascendentale viene interrotta, l'occhio non manterrà la pressione fisiologica e non soddisferà i criteri di ammissibilità per l'uso sperimentale. Si raccomanda di praticare prima il pro...

Le lesioni a globo aperto (OG) possono causare la perdita permanente della vista se non trattate o almeno stabilizzate a seguito dilesioni 1. I ritardi, tuttavia, sono prevalenti in aree remote in cui l'accesso all'intervento oftalmico non è prontamente disponibile, come nelle aree rurali o sul campo di battaglia in scenari militari. Quando il trattamento non è prontamente disponibile, l'attuale standard di cura è quello di proteggere l'occhio con uno scudo rigido fino a quando non è possibile l'intervento medico. In medicina militare, questo ritardo è attualmente fino a 24 ore, ma si prevede che aumenterà fino a 72 ore nelle future operazioni di combattimento in ambienti urbani in cui l'evacuazione aerea non è possibile2,3,4. Questi ritardi possono essere ancora più lunghi nelle applicazioni civili rurali e remote in cui l'accesso all'intervento oftalmico è limitato5,6. Una lesione OG non trattata è altamente suscettibile alle infezioni e alla perdita di pressione intraoculare (IOP) a causa della compromissione della tenuta stagna dell'occhio7,8. La perdita di IOP può influire sulla vitalità dei tessuti, rendendo improbabile qualsiasi intervento medico per ripristinare la vista se il ritardo tra lesione e terapia è troppo lungo9.
Per consentire lo sviluppo di terapie facili da applicare per sigillare le lesioni OG fino a quando non è possibile raggiungere uno specialista oftalmico, è stato precedentemente sviluppato un modello di lesione OG da banco10,11. Con questo modello, sono state create lesioni ad alta velocità in interi occhi suini mentre la IOP è stata catturata dai trasduttori di pressione. Le terapie possono quindi essere applicate per valutare la loro capacità di sigillare il sito di lesione OG12. Tuttavia, poiché questo modello utilizza occhi suini interi, può solo valutare le prestazioni terapeutiche immediate senza alcun modo di monitorare le prestazioni a lungo termine attraverso la possibile finestra di 72 ore in cui il terapeutico deve stabilizzare il sito della lesione fino a quando il paziente non raggiunge cure specialistiche. Di conseguenza, un modello di lesione OG della coltura d'organo del segmento anteriore (ASOC) è stato sviluppato e dettagliato in questo protocollo come piattaforma per il monitoraggio delle prestazioni terapeutiche a lungo termine13.
ASOC è una tecnica ampiamente utilizzata per il mantenimento del tessuto avascolare del segmento anteriore, come la cornea, per più settimane post-enucleazione14,15,16,17. Il segmento anteriore viene mantenuto sotto IOP fisiologica perfondendo il fluido a portate fisiologiche e preservando la regione di deflusso della rete trabecolare, il tessuto responsabile della regolazione della IOP, durante la configurazione ASOC18,19. La piattaforma ASOC può mantenere fisiologicamente il tessuto, indurre una lesione OG utilizzando un dispositivo pneumatico, applicare una terapia e tracciare la stabilizzazione della lesione per almeno 72 ore dopo l'infortunio13.
Qui, il protocollo fornisce una metodologia passo-passo per l'utilizzo della piattaforma ASOC. Per prima cosa descrive in dettaglio come configurare e fabbricare la piattaforma ASOC. Successivamente, il protocollo descrive in dettaglio come sezionare asetticamente il segmento anteriore e mantenere la rete trabecolare, seguita dalla creazione di tessuto del segmento anteriore in piatti di coltura di organi personalizzati. Quindi, descrive in dettaglio come creare lesioni open globe e applicare la terapia immediatamente dopo l'infortunio. Infine, il protocollo fornisce una panoramica sui parametri di caratterizzazione che sono possibili per l'uso con questo metodo che valuta le proprietà funzionali, meccaniche e biologiche dell'occhio e quanto bene la lesione è stata stabilizzata. Nel complesso, questo modello fornisce una piattaforma tanto necessaria per accelerare lo sviluppo del prodotto per stabilizzare e trattare le lesioni open globe e migliorare la prognosi della vista sfavorevole dopo l'infortunio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-32 Socket cap screw, &#189;&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92196A269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ball-End L key</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5020A25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1696484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Intramedic&#160;PE 160 Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-8061WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233T47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium toothed forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail (puncture object)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>97808A503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate, three-way, stopcock with male&#160;luer&#160;lock</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9593742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 18 G&#160;90 degree&#160;angle dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 18 G straight &#189;&#39;&#8217; dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 100 mL beakers with lids</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15704-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas&#160;scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>WP5070</td>
			<td></td>
		</tr>
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anterior segment organ culture platform for tracking open globe injuries and therapeutic performance

Le lesioni open globe hanno scarsi risultati visivi, spesso con conseguente perdita permanente della vista. Ciò è in parte dovuto a un ritardo prolungato tra lesioni e interventi medici in ambienti rurali e applicazioni di medicina militare in cui l'assistenza oftalmica non è prontamente disponibile. Le lesioni non trattate sono suscettibili di infezione dopo che l'occhio ha perso il suo sigillo a tenuta stagna, così come la perdita di vitalità tissutale a causa dell'ipotensione intraoculare. Le terapie per sigillare temporaneamente le lesioni a globo aperto, se adeguatamente sviluppate, possono essere in grado di ripristinare la pressione intraoculare e prevenire l'infezione fino a quando non è possibile un'adeguata cura oftalmica. Per facilitare lo sviluppo del prodotto, qui è dettagliato l'uso di una piattaforma di lesioni open globe per la coltura di organi del segmento anteriore per il monitoraggio delle prestazioni terapeutiche per almeno 72 ore dopo l'infortunio. Il tessuto del segmento anteriore suino può essere mantenuto in piatti di coltura di organi progettati su misura e mantenuto a pressione intraoculare fisiologica. Le lesioni da foratura possono essere create con un sistema pneumatico in grado di generare lesioni fino a 4,5 mm di diametro, simili alle dimensioni delle lesioni rilevanti per l'esercito. La perdita di pressione intraoculare può essere osservata per 72 ore dopo l'infortunio confermando la corretta induzione della lesione e la perdita della tenuta stagna dell'occhio. Le prestazioni terapeutiche possono essere monitorate mediante applicazione all'occhio dopo l'induzione della lesione e quindi il monitoraggio della pressione intraoculare per più giorni. Inoltre, il modello di lesione del segmento anteriore è applicabile ai metodi ampiamente utilizzati per il monitoraggio funzionale e biologico della fisiologia del segmento anteriore, come la valutazione della trasparenza, della meccanica oculare, della salute dell'epitelio corneale e della vitalità dei tessuti. Nel complesso, il metodo qui descritto è un passo successivo necessario verso lo sviluppo di terapie biomateriali per sigillare temporaneamente le lesioni a globo aperto quando la cura oftalmica non è prontamente disponibile.

Le immagini acquisite tramite tomografia a coerenza ottica (OCT) vengono mostrate per gli occhi feriti OG per illustrare come appare un'induzione di lesioni di successo. La Figura 3 mostra le immagini per il controllo e il tessuto AS danneggiato da OG immediatamente dopo l'infortunio e 72 ore dopo. Vengono mostrate due viste: immagini in sezione trasversale attraverso il sito della lesione e proiezione di intensità massima (MIP) dall'alto verso il basso per visualizzare l'area della superfi...

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Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Le lesioni agli occhi open globe possono non essere trattate per più giorni in scenari rurali o militari rilevanti, con conseguente cecità. Le terapie sono necessarie per ridurre al minimo la perdita della vista. Qui, descriviamo in dettaglio un modello di lesione open globe per la coltura di organi. Con questo modello, le potenziali terapie per stabilizzare queste lesioni possono essere valutate correttamente.

Piattaforma di coltura d'organo del segmento anteriore per il monitoraggio delle lesioni Open Globe e delle prestazioni terapeutiche

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

Le lesioni del globo aperto possono portare alla perdita permanente della vista se non trattate. Questo modello di coltura d'organo del segmento anteriore consente di valutare queste lesioni all'interno della necessità di test sugli animali. Questo protocollo consente di tracciare le lesioni open globe e le terapie per stabilizzare la lesione per tre o più giorni con una piattaforma di coltura di organi.A dimostrare la procedura sarà Trent Pearson, un tecnico di ricerca del laboratorio Dr.Boice. Per iniziare, posare il drappo chirurgico e gli strumenti necessari per la dissezione grossolana. Impostare l'armadio di sicurezza bio per visualizzare gli occhi sul microscopio di dissezione.Impostare l'armadio di sicurezza bio per l'assemblaggio del piatto. Imposta l'area di lavoro a induzione per lesioni a globo aperto all'interno dell'armadio di sicurezza bio. Posiziona la morsa di tracciamento incrociato sul jack da laboratorio, di fronte alla piattaforma di foratura.Dopo aver rimosso i tessuti orbitali extra e lavato gli occhi con PBS antimicotico antibiotico, per emisect l'occhio posizionare l'occhio sulla garza antibiotica antimicotica PBS imbevuta. Usa una lama di rasoio sterile o un bisturi per creare un'incisione vicino all'equatore dell'occhio. Quindi emisezionare l'occhio usando forbici chirurgiche curve per isolare l'occhio anteriore.Usa le micro forbici come una pala per raccogliere l'umore vitreo dal segmento anteriore e rimuovere la lente dal segmento anteriore con micro forbici. Tagliare gradualmente l'iride alla radice dell'iride radialmente fino a quando la rete trabecolare è visibile. Estendere il taglio a 360 gradi attorno all'iride, per esporre l'intera regione di rete trabecolare e pulire l'iride residua rimanente che copre la rete trabecolare, se necessario.Tagliare i resti del corpo ciliare posteriormente alla regione trabecolare della rete lasciando solo una banda sottile di un millimetro del tessuto. Dopo aver posizionato il segmento anteriore nella capsula di Petri. Bagnare un batuffolo di cotone nel mezzo e tamponare delicatamente al centro della cornea per rimuovere qualsiasi pigmento.Tenere gli occhi con una pinpetta e rimuovere il pigmento extra intorno alla sclera pulendo. Posizionare il segmento anteriore invertito sopra la regione elevata del piatto inferiore, assicurandosi che la cornea rimanga al centro della regione elevata. Posizionare l'anello di serraggio sopra il segmento anteriore appena posizionato e stringere delicatamente le viti con la chiave L.Collegare entrambi i connettori fluidici con O-ring alle porte filettate sul fondo della parabola. Al primo connettore fluidico collegare mozzo dell'ago piegato a 90 gradi da 18 calibri, una lunghezza di tubo, un mozzo ad ago calibro 18, un filtro a siringa di nylon, una valvola a tre vie e una siringa da 20 millimetri riempita con supporti. Al secondo connettore fluidico collegare mozzo dell'ago piegato a 90 gradi calibro 18, una lunghezza di tubo, un mozzo ad ago calibro 18, una valvola a tre vie come dimostrato per il primo connettore del fluido e quindi collegare la porzione della canna di una siringa sterile da 10 millilitri, che fungerà da serbatoio per catturare il liquido e le bolle.Mantenendo le valvole a tre vie aperte in modo appropriato alle siringhe, spingere delicatamente il fluido attraverso il sistema, utilizzando la prima porta del connettore fluidico. Per gonfiare il segmento anteriore, riempire il tubo con i mezzi e infine riempire il serbatoio. Rimuovere le bolle spingendo delicatamente il supporto nel piatto e invertire il piatto per spingere fuori le bolle.Posizionare la mopia di coltura dell'organo del segmento anteriore nell'incubatore di colture cellulari. Dirigere le linee del tubo attraverso il fondo della porta dell'incubatore per evitare interferenze con l'apertura e la chiusura della porta. Posizionare le linee di tubazione con il serbatoio sullo strumento del trasduttore di pressione.Collegare la valvola laterale a tre vie al trasduttore di pressione impostato mentre PBS scorre attraverso la linea per evitare che le bolle d'aria entrino nelle linee del tubo. All'interno dell'armadio di sicurezza bio preparato per l'induzione di lesioni aperte impostare il regolatore di pressione sulla piattaforma di foratura a 50 libbre di forza per pollice quadrato per generare un'adeguata forza di foratura sugli oggetti fino a 4,5 millimetri di diametro. Posiziona la morsa di tracciamento incrociato sul jack da laboratorio di fronte alla piattaforma di foratura.Estendere il braccio del pistone alla sua distanza massima e posizionare l'apice corneale all'interno della regione di un millimetro dell'oggetto di puntura, ritrarre il braccio del pistone e portare il segmento anteriore un centimetro più vicino all'oggetto di puntura. Per accendere il dispositivo di foratura, accendere il dispositivo e aprire l'elettrovalvola con il secondo interruttore sul dispositivo. Per ritrarre il dispositivo dall'occhio, premere il secondo interruttore, verificare la corretta induzione della lesione mediante ispezione visiva e perdite di supporti dal sito della lesione.Dopo l'intervento chirurgico, l'integrità dell'epitelio corneale è stata valutata tramite imaging utilizzando la tomografia a coerenza ottica. Il tessuto del segmento anteriore ferito è stato ripreso immediatamente dopo l'infortunio e 72 ore dopo l'infortunio. Gli occhi controllati non mostrano interruzioni evidenti nella cornea mentre lesioni chiare sono state localizzate attraverso la cornea dopo la lesione.Dalla proiezione di intensità massima top-down, era evidente che le lesioni erano irregolari nella forma e nelle dimensioni, ma la dimensione della lesione è diminuita nell'arco di 72 ore. La pressione interoculare è stata osservata per i primi tre giorni prima dell'intervento chirurgico per determinare la stabilità della pressione nell'intervallo accettabile. Nei risultati rappresentativi tre occhi su cinque rientrano nell'intervallo di pressione interoculare accettabile.La pressione interoculare cambia a causa della lesione open globe e dell'intervento terapeutico. Dopo l'induzione della lesione a globo aperto, la pressione è diminuita significativamente ed è rimasta bassa fino al completamento dell'esperimento. Il trattamento dei tessuti danneggiati con adesivo dermabond ha comportato un aumento della pressione interoculare rispetto al tessuto non trattato, il che indica che questo metodo può essere utilizzato per misurare l'efficacia delle terapie per il ripristino della pressione intraoculare.La configurazione iniziale del segmento nella coltura degli organi è fondamentale per la stabilità a lungo termine del tessuto. Stringere eccessivamente l'anello può causare stress sul tessuto e ridurre la conformità.

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