Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

تم إجراء التسلسل في مركز تقنيات الحمض النووي بجامعة كاليفورنيا في ديفيس. نشكر مختبر لين تيان في جامعة كاليفورنيا في ديفيس على التدريب على تغليف rAAV وإهدائنا بسخاء مساعد AAV وبلازميدات مندوب / غطاء. تم دعم هذا العمل من قبل NIH / NIGMS R35GM119831.

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (البروتوكول # 22339) ولجنة السلامة الأحيائية المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (BUA-R1903). تم اختبار هذا البروتوكول على الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين في يوم ما بعد الولادة 0-1.
...

يصف هذا البروتوكول طريقة قائمة على rAAV لنشر جينات التحوير التي يحركها المحسن في دماغ الفأر بعد الولادة. في هذا البروتوكول المعمم ، يتم استنساخ محسن مرشح ، ومروج بسيط ، وجين مراسل ، وتسلسل باركود اختياري في العمود الفقري البلازميد AAV. يمكن إجراء هذه التجارب باستخدام تسلسل محسن مرشح واحد أو ب?...

المعززات هي عناصر تنظيمية جينومية لرابطة الدول المستقلة تعمل كمواقع ربط عامل النسخ ويمكنها دفع التعبير عن الجين المستهدف بطريقة محددة زمانيا مكانيا 1,2. وهي نشطة بشكل تفاضلي في أنواع الخلايا والأنسجة ومراحل التطور المختلفة ويمكن أن تكون ركائز للاختلاف الجينومي المرتبط بمخاطر المرض 3,4. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى فهم ديناميكيات وظيفة المحسن أمر بالغ الأهمية للتقدم في كل من التطبيقات العلمية الانتقالية والأساسية في علم الجينوم. في السيليكو ، يمكن أن تكون تنبؤات نشاط المحسن بمثابة موارد ممتازة لتوليد فرضيات حول قدرة المحسن 5,6. يمكن أن يتطلب نشاط المحسن المتوقع هذا التحقق والاستجواب الإضافي لفهم كامل للنشاط الوظيفي. أثبتت فحوصات مراسل Enhancer أنها ذات قيمة لهذا الغرض عبر مجموعة متنوعة من الأنظمة ، من الخلايا إلى الحيوانات7،8،9. من أجل توسيع هذه الدراسات في سياق عابر مرن وفعال من حيث التكلفة في الجسم الحي ، يصف هذا البروتوكول استخدام الأساليب القائمة على AAV في الجسم الحي لاختبار تسلسلات المحسن المفترض لقدرتها على دفع التعبير عن جين مراسل خارج الرحم في دماغ الفأر بعد الولادة. هذه المجموعة من الأساليب لها فائدة لاستجواب تسلسل مرشح واحد أو فحص المكتبة المتوازي وهي ذات صلة بالبحوث الأساسية والانتقالية.
تجمع هذه الطريقة في بلازميد واحد تسلسل الحمض النووي المرشح المفترض مع جين مراسل (هنا EGFP) ، تحت سيطرة مروج الحد الأدنى الذي وحده لا يقود تعبيرا مهما. يتم تعبئة البلازميد في AAV المؤتلف (rAAV) وحقنه في نموذج حيواني. في حين أن التطبيق هنا هو الدماغ ، فإن الأنماط المصلية المختلفة rAAV تمكن العدوى عبر أنواع الأنسجة المختلفة بحيث يمكن توسيع هذا النهج ليشمل أنظمة أخرى10. بعد فترة من الزمن ، يمكن جمع الدماغ وفحصه للتعبير عن جين المراسل. يشير التعبير القوي ، مقارنة بالضوابط ، إلى أن تسلسل المرشح الذي تم اختباره كان قادرا على "تعزيز" التعبير عن الجين (الشكل 1). يوفر هذا التصميم البسيط نهجا سهلا وواضحا لاختبار تسلسل لنشاط المحسن في الجسم الحي في الدماغ.
بالإضافة إلى اختبار قدرة المحسن للتسلسل ، يمكن دمج هذه الطريقة مع تقنيات لتحديد نشاط محسن نوع الخلية. في النهج القائمة على التسلسل لتحديد نشاط المحسن التفاضلي ، يمكن أن يسمح فرز الخلايا على علامات خاصة بنوع الخلية قبل تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي للباحثين بتحديد ما إذا كانت أنواع الخلايا المختلفة تظهر نشاط محسن تفاضلي ، كما هو موضح في Gisselbrecht et al.11. في النهج القائمة على التصوير ، يسمح وضع العلامات المشتركة للصور مع علامات خاصة بنوع الخلية بفحص ما إذا كانت الخلايا التي تظهر مضان مدفوع بالمحسن تعرض أيضا علامات من نوع الخلية ذات الأهمية12،13،14،15،16. تتيح مقايسات مراسل المحسن الاختبار المباشر للتباين الأليل المرتبط بالمخاطر في المعززات للتأثيرات على قدرة المحسن. تقع الغالبية العظمى من مواقع الخطر المحددة في دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) في مناطق غير مشفرة من الجينوم17. تشير دراسات التعليقات التوضيحية الوظيفية لمواقع المخاطر هذه إلى أن جزءا كبيرا من المحتمل أن يعمل كمحسنات18،19،20. يمكن أن يسمح نشر MPRA في الجسم الحي باختبار هذه المتغيرات المرتبطة بالمخاطر لنشاط المحسن في الدماغ12,21. أخيرا ، يمكن أن يقدم التسليم والتجميع في نقاط زمنية مختلفة نظرة ثاقبة لمراحل التطور التي يكون خلالها المحسن نشطا.
تصميمات البلازميد المحسنة-المراسل متنوعة ويمكن تخصيصها لتناسب الأهداف التجريبية. هناك العديد من الخيارات للحد الأدنى من المروجين التي تم استخدامها في أبحاث المحسن ، مثل المروج الأدنى β-globinالبشري 22 والماوس Hsp68 الحد الأدنى من المروج23. من المعروف أن هؤلاء المروجين يقودون مستويات منخفضة من التعبير ما لم يقترن بعنصر محسن لتنشيطهم. في المقابل ، تدفع عناصر المروج التأسيسية تعبيرا قويا عن جين التحوير ، وهو مفيد للتحكم الإيجابي أو لاختبار وظيفة المحسن على خلفية التعبير القوي. تشمل الخيارات الشائعة للمروجين التأسيسيين CAG ، وهو مروج هجين مشتق من مروج الدجاج β الأكتين ومحسن الفيروس المضخم للخلايا الفوريالمبكر 24 ، أو EF1α25 البشري. نظرا لأنه من المعروف أن المعززات تعمل ثنائي الاتجاه26 ، فإن اتجاه وموقع المحسن بالنسبة إلى الحد الأدنى من المروج مرن (الشكل 2 أ). تضع مقايسات المحسن والمراسل التقليدية المحسن في المنبع للمروج ، وفي عمليات تسليم المكتبة ، تتضمن تسلسل الباركود في اتجاه مجرى جين المراسل لربط قراءات التسلسل بالمحسنالمختبر 27. ومع ذلك ، يمكن أيضا وضع المعززات في إطار القراءة المفتوح لجين المراسل وتعمل كتسلسل باركود خاص بها ، كما هو الحال في STARR-seq28. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا تصميم مقايسة STARR-seq ، مما يضع تسلسل محسن المرشح في 3 'UTR لجين المراسل. في حين أن اتجاه STARR-seq يوفر ميزة الاستنساخ الأكثر انسيابية ، إلا أنه أقل فهما من النهج التقليدي وقد يؤدي إلى استقرار متغير للحمض النووي الريبي بين البنى. يمكن تكييف الطرق الموصوفة بسهولة إما مع STARR-seq أو الاتجاه التقليدي مع تعديلات طفيفة على عملية الاستنساخ التي تم وصفها في مكان آخر27,29.
يمكن استخدام طرق مختلفة لتسليم AAV لزيادة تخصيص هذه التقنية لتناسب الأهداف التجريبية (الشكل 2 ب). الحقن المباشر داخل الجمجمة ، الموصوف بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول ، يقدم تركيزا عاليا من الفيروس مباشرة إلى الدماغ30. وهذا يعطي كفاءة نقل عالية تتمركز في موقع الحقن ، مما يجعل هذه تقنية ممتازة للتجارب التي تتطلع إلى زيادة كثافة الخلايا المنقولة إلى أقصى حد على مساحة من الأنسجة. يمكن أن يساعد الحقن التجسيمي في توحيد موقع الحقن عبر الحيوانات من أجل النقل الموضعي القابل للتكرار. الحقن داخل الجمجمة هي الأكثر وضوحا في الحيوانات بعد الولادة المبكرة. كتقنية بديلة ، يمكن للحقن الجهازية توصيل جينات التحوير باستخدام AAVs مع الأنماط المصلية القادرة على عبور الحاجز الدموي الدماغي31. تسمح حقن الوريد الذيل للفيروس بالانتشار في جميع أنحاء الجسم ، مما يتيح التوصيل المعمم عبر العديد من الأنسجة10. الحقن المداري الخلفي هي تقنية حقن جهازية أخرى توصل الفيروس خلف العين إلى الجيب المداريالخلفي 32. يوفر هذا طريقا مباشرا أكثر ل AAV من الجهاز الوريدي إلى الدماغ ، مما يؤدي إلى تركيز أعلى للخلايا المنقولة في الدماغ مقارنة بالحقن في المزيد من الأوعية الدموية المحيطية33.
جانب مرن آخر لهذه التقنية هو طريقة القراءة. بشكل عام ، يمكن وصف الخيارات بأنها قائمة على المراسل أو قائمة على التسلسل (الشكل 2 ج). يؤدي دمج مراسل فلوري مثل GFP في إطار القراءة المفتوح للبناء إلى التعبير عن البروتين الفلوري في أي خلايا محولة حيث قاد المحسن المرشح التعبير. تتيح تقنيات وضع العلامات والتصوير مثل الكيمياء المناعية تضخيم الإشارة. تتضمن تقنيات القراءة القائمة على التسلسل تحديد التسلسلات من البنية المسلمة في الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من الأنسجة. من خلال تحديد كمية الحمض النووي الفيروسي التي تم تسليمها في البداية ، يمكن استخدام مقارنة الحمض النووي الريبي المعبر عنه مقابل الحمض النووي المنقول لتحديد الدرجة التي كان بها تسلسل محسن تم اختباره قادرا على زيادة التعبير عن جين التحوير ، على سبيل المثال ، في سياق مقايسة مراسل موازية على نطاق واسع (MPRA). تقدم MPRAs توسعا قويا لهذه التقنيات لاختبار ما يصل إلى الآلاف من المعززات المرشحة للنشاط في وقت واحد وقد تم وصفها على نطاق واسع في أبحاث الجينوم12،27،34،35،36. يتم تحقيق فحص إنتاجية أعلى من خلال تنفيذ خطوات الاستنساخ والتعبئة والتسليم والتسلسل للمحسنات المرشحة دفعة واحدة وليس بشكل فردي.
يوفر اختيار محسن المرشح فرصة أخرى للمرونة (الشكل 2D). على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد معززات جين معين ، للتأكد من وظيفة مناطق الحمض النووي غير المشفرة ذات الأهمية ، أو لتحديد أنواع معينة من الخلايا أو مراحل النمو التي يكون خلالها المحسن نشطا - وكلها تخدم أهدافا في كل من العلوم الأساسية وأبحاث الأمراض. بشكل عام ، يكون اختيار محسن المرشح مدفوعا بتنبؤات السيليكو لنشاط المحسن. بشكل عام ، في تنبؤات السيليكو تشمل ChIP-seq لتعديلات هيستون التي تشير إلى معززات محتملة ، مثل H3K27ac37 ورسم خرائط إمكانية الوصول إلى الكروماتين38. أخيرا ، هناك مجال متزايد للبحث هو الفحص القائم على الوظيفة لعناصر المحسن المصممة صناعيا ، مما يتيح إجراء دراسات حول كيفية توجيه تسلسل المحسن للوظيفة39 وتصميم المعززات ذات الخصائص المحددة40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

المعززات هي منصات ملزمة لمجموعة متنوعة من عوامل النسخ التي تقود أنماط تعبير محددة للجينات الخاصة بالأنسجة والخلايا. أثبتت الوسائل المتعددة لتقييم الحمض النووي غير المشفر وحالات الكروماتين المختلفة فائدتها في التنبؤ بوجود تسلسلات معززة في الجينوم ، ولكن التحقق من صحة نشاط هذه التسلسلات وإيجاد الأعضاء ومراحل النمو التي تنشط فيها هي عملية كثيفة العمالة. مكنت التطورات الحديثة في ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) من توصيل جينات التحوير على نطاق واسع إلى أنسجة الفئران ، مما مكن من اختبار محسن في الجسم الحي دون الحاجة إلى معدل وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام بنية المراسل التي تعبر عن EGFP تحت سيطرة الحد الأدنى من المروج ، والتي لا تقود تعبيرا مهما من تلقاء نفسها ، لدراسة أنماط نشاط تسلسل محسن المرشح في دماغ الفأر. يتم تسليم بناء مراسل معبأ AAV إلى دماغ الفأر وحضنه لمدة 1-4 أسابيع ، وبعد ذلك يتم التضحية بالحيوان ، ويتم ملاحظة أقسام الدماغ تحت المجهر. يظهر EGFP في الخلايا التي يكون فيها المحسن الذي تم اختباره كافيا لبدء التعبير الجيني ، مع تحديد الموقع ومرحلة النمو التي ينشط فيها المحسن في الدماغ. إن طرق الاستنساخ القياسية ، وتغليف AAV منخفض التكلفة ، وتوسيع الأنماط المصلية AAV وطرق التوصيل في الجسم الحي وقراءات التصوير القياسية تجعل هذا نهجا متاحا لدراسة كيفية تنظيم التعبير الجيني في الدماغ.

باستخدام هذه الطرق ، تم اختبار تسلسل 915 bp في الإنترون الثالث المرتبط بالمخاطر النفسية للجين CACNA1C19،49،50 لنشاط محسن في دماغ الفأر بعد الولادة. تم اكتشاف هذا التسلسل في MPRA من 345 تسلسلا محسنا مرشحا يركز على المخاطر النفسية والعصبية SNPs<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل محسن عابر جديد قائم على rAAV. يمكن استخدام هذا الفحص للحث على التعبير المدفوع بالمحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر.

نشر AAV لبنيات التعبير القائمة على المحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يتيح تصور ليس فقط ما إذا كان تسلسل المحسن يمكن أن يقود التعبير ولكن حيث يمكن أن يدفع التعبير في جزء معين من الجسم. إنه سريع. تستغرق الحقن أقل من 10 دقائق لإكمالها ، ويمكن رؤية ما إذا كان يتم التعبير عن جين المراسل وأين يمكن رؤيته في غضون أيام قليلة من جمع العينة.لبدء الاستنساخ ، اختر أو صمم بنية مراسل. يضع البناء المستخدم هنا المرشح المحسن في المنطقة الثلاثة الرئيسية غير المترجمة لجين مراسل EGFP المعبر عنه تحت سيطرة المروج الأدنى hsp68. لتصميم بادئات PCR لتضخيم تسلسل الاهتمام والاستنساخ في المتجه ، أضف ذراع التماثل المناسب لاستنساخ جيبسون إلى الطرف الأولي الخمسة من البادئات.باستخدام الاشعال المصممة ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل من عينة الحمض النووي. اهضم من واحد إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي المتجه باستخدام Pac1 و Asc1 ، اعتمادا على العدد المطلوب من تفاعلات الاستنساخ المطلوبة. من خلال استخدام 0.7 إلى 1٪ هلام الكهربائي لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 100 فولت ، افصل شظايا هضم التقييد.استخرج الشريط الخاص بالناقل الخطي ، وقم بتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الجل التجارية. بمجرد اكتمال استنساخ جيبسون وتحويل الخلايا ، قم بطلاء الخلايا على وسائط انتقائية ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد التحقق من الاستنساخ الناجح لبناء المراسل ، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من ثقافة البداية باستخدام مخزون الجلسرين.قم بتنمية الثقافة لمدة ثماني إلى 16 ساعة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. عندما يتحول المرق إلى غائم ، قم بتخفيف ثقافة البداية 1،000x في 250 إلى 300 ملليلتر من مرق LB الانتقائي الطازج ، واحتضنها طوال الليل في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. باستخدام مجموعة ماكسي البلازميد التجارية ، قم بتنقية البلازميد.لاختبار إعادة تركيب لوائح الاتصالات الدولية ، قم بإجراء عملية هضم Xma1. تصور العصابات. تأكد من أن الملخص الخاص بك يظهر العدد المتوقع من النطاقات.ستؤدي إعادة التركيب إلى نطاقات أقل من المتوقع. تحضير خليط AAV المؤتلف للتسليم. عند مقارنة أنماط التعبير لفيروسات مراسل محسن متعددة ، قم بتخفيف كل فيروس لمساواة عيار الفيروس بالفيروس الأقل تركيزا.امزج فيروس المراسل المحسن وفيروس المراسل الضابط المعبر عنه بشكل أساسي بنسبة اثنين إلى واحد أو ثلاثة إلى واحد. أضف كمية صغيرة من الصبغة الخضراء السريعة بتركيز نهائي 0.06٪ كسر طرف ماصة زجاجية مسحوبة مصنوعة من أنبوب شعري مدرج بالميكرولتر عن طريق ثقبه برفق في مناديل دقيقة وخالية من النسالة. أدخل الماصة في مجموعة شفاط باستخدام جهاز تطبيق الضغط المتصل بحشية مطاطية لحمل ماصة microcapillary.ارسم حجما صغيرا من حوالي 0.2 إلى 0.5 ميكرولتر من الزيت المعدني في الماصة عن طريق تطبيق ضغط سلبي من خلال الشفاط. احتفظ بمجموعة الشافطة جانبا ، وضع الفيروس على الثلج حتى يصبح جاهزا للحقن. بعد التخدير بالتبريد للفئران حديثي الولادة ، استخدم ضغطا سلبيا باستخدام مجموعة الشافطة ، وارسم خليط الفيروس في الماصة الزجاجية المسحوبة حتى يتجاوز الغضروف المفصلي علامة القراد التي تبلغ سعتها ميكرولتر.خذ الماوس بعيدا عن الغرفة الباردة ، وضعه على سطح الطاولة. حدد موقع مواقع الحقن الثنائية في منتصف الطريق بين لامدا وبريغما ، وكذلك الخيط السهمي وكل عين. قم بتعقيمها باستخدام مناديل كحولية.بيرس جمجمة الفئران حديثي الولادة باستخدام ماصة الزجاج المسحوبة. عندما تدخل الإبرة إلى الجمجمة ، ضع ضغطا إيجابيا من خلال مجموعة الشفاط. الاستغناء عن ميكرولتر واحد من الفيروس في البطين الجانبي ، وسحب ماصة.ضع الماوس على وسادة التدفئة أو غرفة التدفئة للتعافي. أعد الحيوان إلى قفص المنزل بمجرد استيقاظه. سجل صور مضان تنقل قسم الدماغ باستخدام عدسة ذاتية منخفضة التكبير 5x.من خلال تحديد موقع الحقن ، قم بتقييم مدى نقل الفيروس ، اعتمادا على كثافة وشدة خلايا الفلورسنت الحمراء. قارن بين الحيوانات التي تم تحويلها بالمثل. سجل صورا فلورية باستخدام عدسة موضوعية تكبير أعلى تزيد عن 25 ضعفا.بعد ذلك ، افتح برنامج التحليل ، وقم بتطبيق مرشح متوسط ثلاثة في ثلاثة لتقليل الضوضاء. انقر فوق قائمة العملية ، ثم انقر فوق الضوضاء ، واختر خيار Despeckle. بعد ذلك ، لطرح مضان الخلفية من الصور ، ابدأ بفصل قنوات صورة متعددة القنوات.انقر فوق قائمة الصورة ، ثم انقر فوق اللون ، وحدد الخيار تقسيم القنوات. باستخدام أداة تحديد المستطيل أو الدائرة، ارسم شكلا صغيرا في مساحة من الصورة بدون أي خلايا فلورية. قم بقياس متوسط كثافة البكسل للخلفية بالنقر فوق تحليل ثم قياس ، وكرر العينة عدة مرات.متوسط القيمة الرمادية من خمس إلى ثماني مناطق خلفية ، وإسقاط القيم العشرية. اطرح القيم من كل بكسل في الصورة عن طريق تحديد قائمة العملية، ثم انقر على الرياضيات والطرح. بعد ذلك ، أدخل قيمة الخلفية المراد طرحها ، وانقر فوق موافق. إذا لزم الأمر ، قم بدمج القنوات مرة أخرى في صورة متعددة القنوات عن طريق تحديد قائمة الصورة ، ثم انقر فوق اللون ، وحدد دمج القنوات.لحساب عدد خلايا الفلورسنت الخضراء ، قم بإخفاء القناة الخضراء ، وارسم شكلا حول منطقة الدماغ يعبر عن التألق الأحمر باستخدام أداة التحديد الحر. انقر فوق وظيفة القياس لقياس المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية للقناة الحمراء في المنطقة المحددة. احسب عدد الخلايا الخضراء باستخدام أداة تحديد متعددة النقاط ، وقم بتطبيع عدد الخلايا الخضراء حسب الكثافة المتكاملة للقناة الحمراء.بعد تحويل مراسل المحسن أن الفأر الذي تم حقنه داخل الجمجمة في P0 مع بنية AAV إيجابية أظهر تعبير EGFP مدفوعا بالمحسن في الطبقات السفلية الوسطى من القشرة بعد 28 يوما من الحقن. لا يظهر الفأر الذي تم حقنه ببنية تحكم سلبية عند P0 أي تعبير عن EGFP بعد 28 يوما من الحقن ، مما يدل على أن عناصر المحسن موجودة لدفع نسخ EGFP في دماغ الفأر. لتصور المنطقة التي تم تحويلها بنجاح والتحكم في التباين المحتمل ، تم فحص مكتبات مراسل محسن تم تسليمها بواسطة AAV من عيارات مختلفة.تقود مكتبة العيار العالي للمحسنات المرشحة تعبير EGFP الواسع بينما تقود مكتبة العيار السفلي للمحسنات المرشحة تعبير CGFP المتناثر في دماغ الماوس P7. من الضروري مزج مراسل المحسن AAV مع التحكم الإيجابي في كل حقنة من أجل التمييز بين المعززات بدون نشاط وعمليات التسليم الفاشلة. يمكن إقران هذا الإجراء بالكيمياء المناعية أو RNA FISH أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد أنواع الخلايا التي ينشط فيها المحسن.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

وساطة من HSV-التعبير التحوير من همي التركيبات لدراسة وظيفة السلوكية من هذه العملية من Heteromers في الفئران

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

نموذج الفئران من عدوى الدماغ EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...