Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

Sekventering blev udført på UC Davis DNA Technologies Core. Vi takker laboratoriet for Lin Tian på UC Davis for træning i rAAV-emballage og generøst forærende os AAV-hjælper og rep / cap-plasmider. Dette arbejde blev støttet af NIH/NIGMS R35GM119831.

Denne protokol er godkendt af UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokol #22339) og UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Denne protokol er blevet testet på C57BL/6J mus af begge køn på postnatal dag 0-1.
1. Klon forstærkerkandidatsekvensen ind i AAV-vektorplasmidet.
BEMÆRK: De repræsentative protokoller er angivet, men kloningsstrategien har en høj grad af fleksibilitet.
<ol><li>Vælg eller design en r...

Denne protokol beskriver en rAAV-baseret metode til implementering af forstærkerdrevne transgener i den postnatale musehjerne. I denne generaliserede protokol klones en kandidatforstærker, en minimal promotor, et reportergen og en valgfri stregkodesekvens til en AAV-plasmidrygrad. Disse eksperimenter kan udføres med en enkelt kandidatforstærkersekvens eller med mange sekvenser parallelt. Plamidlet pakkes i en rAAV og leveres til den postnatale musehjerne. Efter en periode for at muliggøre virustransduktion indsamles...

Enhancers er genomiske cis-regulatoriske elementer, der tjener som transkriptionsfaktorbindingssteder og kan drive ekspressionen af et målgen på en spatiotemporalt specifik måde 1,2. De er forskelligt aktive i forskellige celletyper, væv og udviklingsstadier og kan være substrater for sygdomsrisikorelateret genomisk variation 3,4. Behovet for at forstå dynamikken i forstærkerfunktionen er således afgørende for fremskridt inden for både translationelle og grundlæggende videnskabelige applikationer inden for genomik. In silico forudsigelser af forstærkeraktivitet kan tjene som fremragende ressourcer til at generere hypoteser om forstærkerkapacitet 5,6. En sådan forudsagt forstærkeraktivitet kan kræve yderligere validering og forhør for en fuld forståelse af den funktionelle aktivitet. Enhancer reporter-assays har vist sig værdifulde til dette formål på tværs af en række systemer, fra celler til dyr 7,8,9. Mod at udvide disse undersøgelser i en fleksibel og omkostningseffektiv forbigående in vivo-sammenhæng beskriver denne protokol brugen af in vivo AAV-baserede metoder til at teste formodede forstærkersekvenser for deres evne til at drive ekspressionen af et ektopisk reportergen i den postnatale musehjerne. Denne familie af metoder har nytte til at forhøre enkeltkandidatsekvenser eller parallel biblioteksscreening og er relevant for grundlæggende og translationel forskning.
Denne metode kombinerer i et enkelt plasmid en formodet forstærkerkandidat-DNA-sekvens med et reportergen (her EGFP) under kontrol af en minimal promotor, der alene ikke driver signifikant ekspression. Plasmidet pakkes i rekombinant AAV (rAAV) og injiceres i en dyremodel. Mens applikationen her er til hjernen, muliggør forskellige rAAV-serotyper infektion på tværs af forskellige vævstyper, så denne tilgang kan udvides til andre systemer10. Efter en periode kan hjernen indsamles og analyseres til ekspression af reportergenet. Stærk ekspression sammenlignet med kontroller indikerer, at den testede kandidatsekvens var i stand til at "forbedre" ekspressionen af genet (figur 1). Dette enkle design tilbyder en nem og klar tilgang til at teste en sekvens for forstærkeraktivitet in vivo i hjernen.
Ud over at teste for forstærkerens evne til en sekvens kan denne metode kombineres med teknikker til bestemmelse af celletypeforstærkeraktivitet. I sekvensbaserede tilgange til bestemmelse af differentiel forstærkeraktivitet kan sortering af celler på celletypespecifikke markører forud for DNA- og RNA-sekventering give forskere mulighed for at bestemme, om forskellige celletyper viser differentiel forstærkeraktivitet, som det blev beskrevet i Gisselbrecht et al.11. I billeddannelsesbaserede tilgange tillader co-mærkning af billeder med celletypespecifikke markører undersøgelse af, om celler, der udviser forstærkerdrevet fluorescens, også viser celletypemarkører af interesse 12,13,14,15,16. Enhancer reporter-assays muliggør direkte test af risikoassocieret allelvariation i forstærkere for effekter på forstærkerens kapacitet. Langt størstedelen af de risikoområder, der er identificeret i genom-dækkende associeringsundersøgelser (GWAS), ligger i ikke-kodende regioner i genomet17. Funktionelle annotationsundersøgelser af disse risikosteder indikerer, at en stor del sandsynligvis fungerer som forstærkere18,19,20. MPRA-implementering in vivo kan muliggøre test af disse risikoassocierede varianter for forstærkeraktivitet i hjernen12,21. Endelig kan levering og afhentning på forskellige tidspunkter give indsigt i de udviklingsstadier, hvor en forstærker er aktiv.
Enhancer-reporter plasmid design er forskellige og kan tilpasses til at passe til eksperimentelle mål. Der er flere muligheder for minimale promotorer, der er blevet brugt i forstærkerforskning, såsom den menneskelige β-globin minimal promotor22 og musen Hsp68 minimal promotor23. Disse promotorer er kendt for at drive lave udtryksniveauer, medmindre de kombineres med et forstærkerelement for at aktivere dem. I modsætning hertil driver konstitutive promotorelementer stærk ekspression af transgenet, nyttigt til positiv kontrol eller til at teste for forstærkerfunktion på baggrund af robust ekspression. Almindelige valg for konstitutive promotorer omfatter CAG, en hybridpromotor afledt af kylling β-actin-promotoren og cytomegalovirus øjeblikkelig-tidlig forstærker24 eller human EF1α25. Da forstærkere vides at arbejde tovejs26, er forstærkerens orientering og placering i forhold til den minimale promotor fleksibel (figur 2A). Traditionelle forstærker-reporter-assays placerer forstærkeren opstrøms for promotoren og inkluderer i biblioteksleverancer en stregkodesekvens nedstrøms for reportergenet for at forbinde sekventeringslæsninger med den testede forstærker27. Forstærkere kan dog også placeres i den åbne læseramme af reportergenet og fungere som deres egen stregkodesekvens, som det gøres i STARR-seq28. Protokollen, der er beskrevet her, anvender STARR-seq-analysedesignet og placerer kandidatforstærkersekvensen i 3 'UTR af reportergenet. Mens STARR-seq-orienteringen giver fordelen ved mere strømlinet kloning, er den mindre godt forstået end den konventionelle tilgang og kan inducere variabel RNA-stabilitet mellem konstruktioner. De beskrevne metoder kan let tilpasses enten STARR-seq eller konventionel orientering med mindre ændringer i kloningsprocessen, der er beskrevet andetsteds27,29.
Forskellige metoder til AAV-levering kan anvendes til yderligere at tilpasse denne teknik, så den passer til eksperimentelle mål (figur 2B). Direkte intrakranielle injektioner, beskrevet yderligere i denne protokol, leverer en høj koncentration af virus direkte til hjernen30. Dette giver en høj transduktionseffektivitet centreret på injektionsstedet, hvilket gør dette til en fremragende teknik til eksperimenter, der søger at maksimere tætheden af transducerede celler over et vævsområde. Stereotaktisk injektion kan hjælpe med at standardisere injektionsstedet på tværs af dyr til reproducerbar lokaliseret transduktion. Intrakranielle injektioner er mest ligetil hos tidlige postnatale dyr. Som en alternativ teknik kan systemiske injektioner levere transgener ved hjælp af AAV'er med serotyper, der er i stand til at krydse blod-hjerne-barrieren31. Hale-vene injektioner tillader virus at cirkulere i hele kroppen, hvilket muliggør generaliseret levering på tværs af mange væv10. Retro-orbitale injektioner er en anden systemisk injektionsteknik, der leverer virussen bag øjet ind i retro-orbital sinus32. Dette giver en mere direkte rute for AAV fra det venøse system til hjernen, hvilket resulterer i en højere koncentration af transducerede celler i hjernen end injektioner i mere perifere blodkar33.
Et andet fleksibelt aspekt af denne teknik er metoden til udlæsning. Generelt kan optioner beskrives som reporterbaserede eller sekventeringsbaserede (figur 2C). Inkorporering af en fluorescerende reporter som GFP i konstruktionens åbne læseramme resulterer i ekspression af det fluorescerende protein i alle transducerede celler, hvor kandidatforstærkeren drev udtryk. Mærkning og billeddannelsesteknikker såsom immunhistokemi muliggør signalforstærkning. Sekventering baseret udlæsning teknikker involverer identifikation af sekvenser fra den leverede konstruktion i RNA indsamlet fra vævet. Ved at kvantificere mængden af viralt DNA, der oprindeligt blev leveret, kan sammenligningen af udtrykt RNA versus leveret DNA bruges til at bestemme, i hvilken grad en testet forstærkersekvens var i stand til at drive øget ekspression af transgenet, for eksempel i forbindelse med et massivt parallelt reporterassay (MPRA). MPRA'er tilbyder en kraftig udvidelse af disse teknikker til at teste op til tusindvis af kandidatforstærkere for aktivitet samtidigt og er blevet beskrevet udførligt i genomforskning 12,27,34,35,36. Højere gennemløbsscreening opnås ved at udføre klonings-, emballerings-, leverings- og sekventeringstrin for kandidatforstærkere i batch snarere end individuelt.
Valg af kandidatforstærker giver endnu en mulighed for fleksibilitet (figur 2D). For eksempel kan dette assay bruges til at identificere forstærkere af et specifikt gen, til at fastslå funktionen af ikke-kodende DNA-regioner af interesse eller til at bestemme specifikke celletyper eller udviklingsstadier, hvor en forstærker er aktiv - som alle tjener mål både inden for grundvidenskab og sygdomsforskning. Generelt er valg af kandidatforstærker drevet af in silico-forudsigelser af forstærkeraktivitet. Almindeligvis inkluderer in silico-forudsigelser ChIP-seq for histonmodifikationer, der indikerer sandsynlige forstærkere, såsom H3K27ac37 og chromatintilgængelighedskortlægning38. Endelig er et voksende forskningsområde den funktionsbaserede screening af syntetisk designede forstærkerelementer, der muliggør undersøgelser af, hvordan forstærkersekvensen styrer funktion39 og design af forstærkere med specifikke egenskaber40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Enhancers er bindende platforme for en bred vifte af transkriptionsfaktorer, der driver specifikke ekspressionsmønstre af vævs- og celletypespecifikke gener. Flere midler til vurdering af ikke-kodende DNA og forskellige kromatintilstande har vist sig nyttige til at forudsige tilstedeværelsen af forstærkersekvenser i genomet, men validering af aktiviteten af disse sekvenser og at finde de organer og udviklingsstadier, de er aktive i, er en arbejdskrævende proces. De seneste fremskridt inden for adeno-associerede virusvektorer (AAV) har muliggjort udbredt levering af transgener til musevæv, hvilket muliggør in vivo-forstærkertest uden at kræve et transgent dyr. Denne protokol viser, hvordan en reporterkonstruktion, der udtrykker EGFP under kontrol af en minimal promotor, som ikke driver signifikant udtryk alene, kan bruges til at studere aktivitetsmønstrene for kandidatforstærkersekvenser i musehjernen. En AAV-pakket reporterkonstruktion leveres til musehjernen og inkuberes i 1-4 uger, hvorefter dyret ofres, og hjerneafsnit observeres under et mikroskop. EGFP forekommer i celler, hvor den testede forstærker er tilstrækkelig til at initiere genekspression, der lokaliserer placeringen og udviklingsstadiet, hvor forstærkeren er aktiv i hjernen. Standard kloningsmetoder, billig AAV-emballage og udvidelse af AAV-serotyper og metoder til in vivo-levering og standardbilleddannelsesaflæsning gør dette til en tilgængelig tilgang til undersøgelse af, hvordan genekspression reguleres i hjernen.

Ved hjælp af disse metoder blev en 915 bp-sekvens i den psykiatriske risikoassocierede tredje intron af genet CACNA1C19,49,50 testet for forstærkeraktivitet i den postnatale musehjerne. Denne sekvens blev opdaget i en MPRA af 345 kandidatforstærkersekvenser centreret om psykiatriske og neurologiske risiko SNP'er12, og karakteriseringseksperimenter beskrives her som et generelt eksempel. C57BL/...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Denne protokol beskriver et nyt rAAV-baseret forbigående forstærker-reporter-assay. Dette assay kan bruges til at inducere forstærkerdrevet udtryk in vivo i musehjernen.

AAV-implementering af forstærkerbaserede ekspressionskonstruktioner in vivo i musehjerne

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Denne protokol er vigtig, fordi den muliggør visualisering af ikke kun, om en forstærkersekvens kan drive udtryk, men hvor den kan drive udtryk i en bestemt del af kroppen. Det er hurtigt. Injektionerne tager mindre end 10 minutter at gennemføre, og hvorvidt og hvor et reportergen udtrykkes, kan ses inden for få dage efter prøveindsamling.For at starte kloningen skal du vælge eller designe en reporterkonstruktion. Den konstruktion, der anvendes her, placerer forstærkerkandidaten i de tre primære uoversatte regioner i et EGFP-reportergen udtrykt under kontrol af hsp68 minimal promotor. For at designe PCR-primerne til forstærkning af en sekvens af interesse og kloning i vektoren skal du tilføje den passende homologiarm til Gibson-kloning til den fem primære ende af primerne.Brug de designede primere til at udføre PCR fra en DNA-prøve. Fordøje et til 10 mikrogram vektor-DNA ved hjælp af Pac1 og Asc1, afhængigt af det ønskede antal af de krævede kloningsreaktioner. Ved at anvende 0,7 til 1% gelelektroforese i 30 til 60 minutter ved 100 volt adskilles begrænsningsfordøjelsesfragmenterne.Ekstraher båndet til den lineariserede vektor, og rens det med et kommercielt gelekstraktionssæt. Når Gibson-kloningen og transformationen af celler er afsluttet, plade cellerne på selektive medier og inkuberer natten over ved 37 grader Celsius. Efter at have verificeret den vellykkede kloning af reporterkonstruktionen, podes fem milliliter af starterkulturen ved hjælp af glycerolbestanden.Dyrk kulturen i otte til 16 timer i en rystende inkubator ved 30 grader Celsius og 180 rotationer pr. Minut. Når bouillon bliver overskyet, fortyndes startkulturen 1.000x i 250 til 300 ml frisk selektiv LB bouillon og inkuberes natten over i en rystende inkubator ved 30 grader Celsius og 180 rotationer pr. Minut. Brug et kommercielt plasmid maxi-sæt til at rense plasmidet.For at teste for rekombination af ITR'erne skal du udføre en Xma1-fordøjelse. Visualiser båndene. Sørg for, at din fordøjelse viser det forventede antal bånd.Rekombination vil resultere i færre end forventede bånd. Forbered rekombinant AAV-blanding til levering. Hvis du sammenligner ekspressionsmønstrene for flere forstærkerreportervirus, skal du fortynde hver virus for at sidestille virustiterne med den mindst koncentrerede virus.Bland forstærkerreportervirus og konstitutivt udtrykt kontrolreportervirus i et forhold på to til en eller tre til en. Tilsæt en lille mængde hurtigt grønt farvestof med en endelig koncentration på 0,06% Bryd spidsen af en trukket glaspipette lavet af et mikrolitergradueret kapillarrør ved forsigtigt at gennembore det til en delikat, fnugfri klud. Indsæt pipetten i en aspiratorenhed med en trykpåføringsanordning forbundet til en gummipakning til at holde en mikrokapillærpipette.Træk et lille volumen på ca. 0,2 til 0,5 mikroliter mineralolie ind i pipetten ved at påføre undertryk gennem aspiranten. Hold aspiratorsamlingen til side, og læg virussen på is, indtil den er klar til injektion. Efter kryobedøvelse af neonatalmusene påføres negativt tryk ved hjælp af aspiratorenheden og trækkes virusblandingen ind i den trukne glaspipette, indtil menisken passerer to-mikroliter krydsmærket.Tag musen væk fra kølekammeret, og læg den på bordpladen. Find de bilaterale injektionssteder midtvejs mellem lambda og bregma samt sagittal sutur og hvert øje. Desinficer dem ved hjælp af en alkoholserviet.Gennembor kraniet på de neonatale mus ved hjælp af den trukne glaspipette. Når nålen kommer ind i kraniet, skal du anvende et positivt tryk gennem aspiratorenheden. Dispenser en mikroliter af virussen i lateral ventriklen, og træk pipetten ud.Placer musen på en varmepude eller et varmekammer for at komme sig. Returner dyret til hjemmeburet, når det er vågnet. Optag fluorescensbilleder, der krydser hjernesektionen ved hjælp af en lav forstørrelse 5x subjektiv linse.Ved at lokalisere injektionsstedet evalueres omfanget af virustransduktion afhængigt af tætheden og intensiteten af røde fluorescerende celler. Sammenlign de dyr, der blev transduceret på samme måde. Optag fluorescerende billeder med et objektiv med højere forstørrelsesmål på mere end 25x.Åbn derefter analysesoftwaren, og anvend et tre-til-tre medianfilter for at reducere støj. Klik på menuen Proces, klik derefter på Støj, og vælg indstillingen Despeckle. For at trække baggrundsfluorescensen fra billederne skal du starte med at adskille kanalerne i et flerkanalsbillede.Klik på menuen Billede, klik derefter på Farve, og vælg indstillingen Opdel kanaler. Brug rektangel- eller cirkelvalgsværktøjet til at tegne en lille form i et område af billedet uden fluorescerende celler. Mål den gennemsnitlige pixelintensitet i baggrunden ved at klikke på Analyser og derefter Måling, og gentag for at prøve flere gange.Gennemsnit den gennemsnitlige grå værdi fra fem til otte baggrundsområder, og slip decimalværdierne. Træk værdierne fra hver pixel i billedet ved at vælge menuen Proces, og klik derefter på Matematik og Træk fra. Indtast derefter baggrundsværdien for at trække fra, og klik på OK. Hvis det er nødvendigt, skal du flette kanalerne tilbage til et flerkanalsbillede ved at vælge menuen Billede, derefter klikke på Farve og vælge Flet kanaler.For at tælle antallet af grønne fluorescerende celler skal du skjule den grønne kanal og tegne en form omkring hjerneområdet, der udtrykker rød fluorescens ved hjælp af værktøjet til valg af fri form. Klik på målingsfunktionen for at måle arealet, den integrerede tæthed og den gennemsnitlige grå værdi af den røde kanal i den valgte zone. Tæl antallet af grønne celler ved hjælp af et flerpunktsmarkeringsværktøj, og normaliser antallet af grønne celler med den integrerede intensitet af den røde kanal.Efter transducering af forstærkerreporteren viste musen intrakranielt ved P0 med en positiv AAV-konstruktion forstærkerdrevet EGFP-ekspression i de midterste nedre lag af cortex 28 dage efter injektion. Musen injiceret med en negativ kontrolkonstruktion ved P0 viser ikke noget udtryk for EGFP 28 dage efter injektion, hvilket viser, at forstærkerelementerne viser sig at drive transkription af EGFP i musehjernen. For at visualisere det vellykkede transducerede område og kontrol for potentiel variabilitet blev AAV-leverede forstærkerreporterbiblioteker med forskellige titere undersøgt.Det høje titerbibliotek af kandidatforstærkere driver bredt EGFP-udtryk, mens det lavere titerbibliotek af kandidatforstærkere driver sparsomt CGFP-udtryk i P7-musehjernen. Det er vigtigt at blande forstærkeren AAV med den positive kontrol ved hver injektion for at skelne mellem forstærkere uden aktivitet og mislykkede leverancer. Denne procedure kan parres med immunhistokemi, RNA FISH eller enkeltcellet RNA-sekventering for at bestemme, hvilke celletyper en forstærker er aktiv i.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation (Video) | JoVE

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Oprensning af musehjerne Fartøjer

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-medieret transgene ekspression af kimære konstruktioner at undersøge adfærdsmæssige funktion GPCR heteromerer i mus

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Målrettet udtryk af Optogenetic proteiner ved hjælp af silke/AAV film

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillær to-foton In vivo Billeddannelse af musens nethinde

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

En rottemodel af EcoHIV-hjerneinfektion

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...