Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

Sequencing werd uitgevoerd in de UC Davis DNA Technologies Core. We bedanken het lab van Lin Tian bij UC Davis voor de training over rAAV-verpakkingen en het genereus schenken van AAV-helper en rep / cap-plasmiden. Dit werk werd ondersteund door NIH/NIGMS R35GM119831.

Dit protocol is goedgekeurd door de UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #22339) en de UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Dit protocol is getest op C57BL/6J muizen van beide geslachten op postnatale dag 0-1.
1. Kloon de enhancer kandidaat-sequentie in het AAV-vectorplasmide.
OPMERKING: De representatieve protocollen worden gegeven, maar de kloonstrategie heeft een hoge mate van flexibiliteit.
<ol><li>...

Dit protocol beschrijft een op rAAV gebaseerde methode voor de inzet van enhancer-gedreven transgenen in het postnatale muizenbrein. In dit gegeneraliseerde protocol worden een kandidaat-versterker, een minimale promotor, een reporter-gen en een optionele barcodesequentie gekloond in een AAV-plasmide-ruggengraat. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd met een enkele kandidaat-enhancersequentie of met veel sequenties parallel. Het plasmide wordt verpakt in een rAAV en afgeleverd bij de postnatale muizenhersenen. Na ee...

Versterkers zijn genomische cis-regulerende elementen die dienen als transcriptiefactorbindingsplaatsen en de expressie van een doelgen op een spatiotemporaal specifieke manier kunnen stimuleren 1,2. Ze zijn differentieel actief in verschillende celtypen, weefsels en ontwikkelingsstadia en kunnen substraten zijn van ziekterisicogerelateerde genomische variatie 3,4. De noodzaak om de dynamiek van de enhancer-functie te begrijpen is dus van cruciaal belang voor vooruitgang in zowel translationele als fundamentele wetenschappelijke toepassingen binnen genomica. In silico kunnen voorspellingen van enhancer-activiteit dienen als uitstekende bronnen voor het genereren van hypothesen als voor enhancer-capaciteit 5,6. Een dergelijke voorspelde enhancer-activiteit kan aanvullende validatie en ondervraging vereisen voor een volledig begrip van de functionele activiteit. Enhancer reporter assays zijn waardevol gebleken voor dit doel in verschillende systemen, van cellen tot dieren 7,8,9. Om deze studies uit te breiden in een flexibele en kosteneffectieve voorbijgaande in vivo context, beschrijft dit protocol het gebruik van in vivo AAV-gebaseerde methoden om vermeende enhancersequenties te testen op hun vermogen om de expressie van een ectopisch reportergen in het postnatale muizenbrein te stimuleren. Deze familie van methoden heeft nut voor het ondervragen van enkele kandidaatsequenties of parallelle bibliotheekscreening en is relevant voor fundamenteel en translationeel onderzoek.
Deze methode combineert in een enkel plasmide een vermeende versterker kandidaat-DNA-sequentie met een reporter-gen (hier EGFP), onder de controle van een minimale promotor die alleen geen significante expressie stimuleert. Het plasmide wordt verpakt in recombinant AAV (rAAV) en geïnjecteerd in een diermodel. Hoewel de toepassing hier op de hersenen is, maken verschillende rAAV-serotypen infectie in verschillende weefseltypen mogelijk, zodat deze aanpak kan worden uitgebreid naar andere systemen10. Na verloop van tijd kunnen de hersenen worden verzameld en getest op de expressie van het reporter-gen. Sterke expressie, vergeleken met controles, geeft aan dat de geteste kandidaatsequentie in staat was om de expressie van het gen te "verbeteren" (figuur 1). Dit eenvoudige ontwerp biedt een eenvoudige en duidelijke aanpak om een reeks te testen op versterkeractiviteit in vivo in de hersenen.
Naast het testen op het vermogen van een versterker van een sequentie, kan deze methode worden gecombineerd met technieken om de activiteit van het celtype versterker te bepalen. In sequentiegebaseerde benaderingen voor het bepalen van differentiële versterkeractiviteit, kan het sorteren van cellen op celtypespecifieke markers voorafgaand aan DNA- en RNA-sequencing onderzoekers in staat stellen om te bepalen of verschillende celtypen differentiële versterkeractiviteit vertonen, zoals werd beschreven in Gisselbrecht et al.11. In op beeldvorming gebaseerde benaderingen maakt co-labeling van afbeeldingen met celtypespecifieke markers het mogelijk om te onderzoeken of cellen met enhancer-gedreven fluorescentie ook celtypemarkers van belang weergeven 12,13,14,15,16. Enhancer reporter assays maken directe testen van risico-geassocieerde allelische variatie in versterkers mogelijk op effecten op het vermogen van enhancers. De overgrote meerderheid van de risicoloci die in genoombrede associatiestudies (GWAS) zijn geïdentificeerd, ligt in niet-coderende regio's van het genoom17. Functionele annotatiestudies van deze risicoloci geven aan dat een groot deel waarschijnlijk fungeert als versterkers 18,19,20. MPRA-implementatie in vivo kan het testen van deze risico-geassocieerde varianten voor versterkeractiviteit in de hersenen mogelijk maken12,21. Tot slot kan levering en afhaling op verschillende tijdstippen inzicht bieden in de ontwikkelingsfasen waarin een versterker actief is.
Enhancer-reporter plasmide ontwerpen zijn divers en kunnen worden aangepast aan experimentele doelen. Er zijn verschillende opties voor minimale promotors die zijn gebruikt in versterkeronderzoek, zoals de humane β-globine minimale promotor22 en de muis Hsp68 minimal promoter23. Van deze promotors is bekend dat ze lage expressieniveaus stimuleren, tenzij ze worden gekoppeld aan een enhancer-element om ze te activeren. Constitutieve promotorelementen daarentegen stimuleren een sterke expressie van het transgen, nuttig voor positieve controle of om te testen op enhancer-functie tegen een achtergrond van robuuste expressie. Veel voorkomende keuzes voor constitutieve promotors zijn CAG, een hybride promotor afgeleid van de kip β-actine promotor en de cytomegalovirus onmiddellijk-vroege versterker24, of humaan EF1α25. Aangezien van versterkers bekend is dat ze bidirectioneel werken26, zijn de oriëntatie en locatie van de versterker ten opzichte van de minimale promotor flexibel (figuur 2A). Traditionele enhancer-reporter assays plaatsen de enhancer stroomopwaarts van de promotor en omvatten in bibliotheekleveringen een barcodesequentie stroomafwaarts van het reporter-gen om sequencing reads te associëren met de geteste enhancer27. Versterkers kunnen echter ook in het open leesframe van het reporter-gen worden geplaatst en dienen als hun eigen barcodesequentie, zoals wordt gedaan in STARR-seq28. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van het STARR-seq-testontwerp, waarbij de kandidaat-enhancersequentie in de 3 'UTR van het reporter-gen wordt geplaatst. Hoewel de STARR-seq-oriëntatie het voordeel biedt van meer gestroomlijnd klonen, is het minder goed begrepen dan de conventionele benadering en kan het variabele RNA-stabiliteit tussen constructen induceren. De beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast aan de STARR-seq of conventionele oriëntatie met kleine wijzigingen in het kloonproces die elders zijn beschreven27,29.
Verschillende methoden voor AAV-levering kunnen worden gebruikt om deze techniek verder aan te passen aan experimentele doelen (figuur 2B). Directe intracraniale injecties, verder beschreven in dit protocol, leveren een hoge concentratie virus rechtstreeks aan de hersenen30. Dit geeft een hoge transductie-efficiëntie gecentreerd op de injectieplaats, waardoor dit een uitstekende techniek is voor experimenten die de dichtheid van getransduceerde cellen over een weefselgebied willen maximaliseren. Stereotactische injectie kan helpen bij het standaardiseren van de injectieplaats bij dieren voor reproduceerbare gelokaliseerde transductie. Intracraniale injecties zijn het eenvoudigst bij vroege postnatale dieren. Als alternatieve techniek kunnen systemische injecties transgenen afleveren met behulp van AAV's met serotypen die de bloed-hersenbarrière kunnen passeren31. Staartaderinjecties laten het virus door het lichaam circuleren, waardoor gegeneraliseerde afgifte over veel weefsels mogelijk wordt10. Retro-orbitale injecties zijn een andere systemische injectietechniek die het virus achter het oog afgeeft in de retro-orbitale sinus32. Dit biedt een directere route voor de AAV van het veneuze systeem naar de hersenen, wat resulteert in een hogere concentratie van getransduceerde cellen in de hersenen dan injecties in meer perifere bloedvaten33.
Een ander flexibel aspect van deze techniek is de methode van uitlezing. In grote lijnen kunnen opties worden beschreven als reporter-based of sequencing-based (figuur 2C). Het opnemen van een fluorescerende reporter zoals GFP in het open leesframe van het construct resulteert in de expressie van het fluorescerende eiwit in alle getransduceerde cellen waar de kandidaat-versterker expressie aandreef. Etiketterings- en beeldvormingstechnieken zoals immunohistochemie maken signaalversterking mogelijk. Sequencing-gebaseerde uitleestechnieken omvatten het identificeren van sequenties van het geleverde construct in RNA verzameld uit het weefsel. Door de hoeveelheid viraal DNA te kwantificeren die aanvankelijk werd afgeleverd, kan de vergelijking van uitgedrukt RNA versus afgeleverd DNA worden gebruikt om de mate te bepalen waarin een geteste versterkersequentie in staat was om verhoogde expressie van het transgen te stimuleren, bijvoorbeeld in de context van een massaal parallelle reporter assay (MPRA). MPRA's bieden een krachtige uitbreiding van deze technieken om tot duizenden kandidaat-versterkers tegelijkertijd op activiteit te testen en zijn uitgebreid beschreven in genomics-onderzoek 12,27,34,35,36. Screening met een hogere doorvoer wordt bereikt door het uitvoeren van kloon-, verpakkings-, leverings- en sequencingstappen voor kandidaat-versterkers in batch in plaats van individueel.
De selectie van kandidatenversterkers biedt een andere mogelijkheid voor flexibiliteit (figuur 2D). Deze test kan bijvoorbeeld worden gebruikt om versterkers van een specifiek gen te identificeren, om de functie van niet-coderende DNA-regio's van belang vast te stellen, of om specifieke celtypen of ontwikkelingsstadia te bepalen waarin een versterker actief is - die allemaal doelen dienen, zowel in de basiswetenschap als in ziekteonderzoek. Over het algemeen wordt de selectie van kandidaat-versterkers aangedreven door in silico-voorspellingen van versterkeractiviteit. Gewoonlijk omvatten in silico-voorspellingen ChIP-seq voor histonmodificaties die wijzen op waarschijnlijke versterkers, zoals H3K27ac37 en chromatine accessibility mapping38. Ten slotte is een groeiend onderzoeksgebied de functiegebaseerde screening van synthetisch ontworpen enhancer-elementen, waardoor studies mogelijk worden gemaakt van hoe enhancer-sequentie functie39 stuurt en het ontwerp van enhancers met specifieke eigenschappen40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Versterkers zijn bindingsplatforms voor een breed scala aan transcriptiefactoren die specifieke expressiepatronen van weefsel- en celtypespecifieke genen aansturen. Meerdere middelen om niet-coderend DNA en verschillende chromatinetoestanden te beoordelen, zijn nuttig gebleken bij het voorspellen van de aanwezigheid van enhancersequenties in het genoom, maar het valideren van de activiteit van deze sequenties en het vinden van de organen en ontwikkelingsstadia waarin ze actief zijn, is een arbeidsintensief proces. Recente ontwikkelingen in adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren hebben de wijdverspreide levering van transgenen aan muizenweefsels mogelijk gemaakt, waardoor in vivo versterkertests mogelijk zijn zonder dat een transgeen dier nodig is. Dit protocol laat zien hoe een reporterconstructie die EGFP uitdrukt onder controle van een minimale promotor, die op zichzelf geen significante expressie aandrijft, kan worden gebruikt om de activiteitspatronen van kandidaat-versterkersequenties in het muizenbrein te bestuderen. Een AAV-verpakte reporterconstructie wordt afgeleverd bij de hersenen van de muis en gedurende 1-4 weken geïncubeerd, waarna het dier wordt geofferd en hersensecties onder een microscoop worden waargenomen. EGFP verschijnt in cellen waarin de geteste versterker voldoende is om genexpressie te initiëren, waarbij de locatie en het ontwikkelingsstadium waarin de versterker actief is in de hersenen wordt bepaald. Standaard kloonmethoden, goedkope AAV-verpakkingen en uitbreidende AAV-serotypen en -methoden voor in vivo levering en standaard beeldvormingsuitlezing maken dit een toegankelijke benadering voor de studie van hoe genexpressie in de hersenen wordt gereguleerd.

Met behulp van deze methoden werd een 915 bp-sequentie in het psychiatrische risico-geassocieerde derde intron van het gen CACNA1C 19,49,50 getest op versterkeractiviteit in de postnatale muizenhersenen. Deze sequentie werd ontdekt in een MPRA van 345 kandidaat-enhancersequenties gericht op psychiatrische en neurologische risico-SNP's12 en karakteriseringsexperimenten worden hier beschreven als e...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Dit protocol beschrijft een nieuwe rAAV-gebaseerde transient enhancer-reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om enhancer-gedreven expressie in vivo in het muizenbrein te induceren.

AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Dit protocol is belangrijk omdat het visualisatie mogelijk maakt van niet alleen of een enhancer-reeks expressie kan stimuleren, maar ook waar het expressie in een bepaald deel van het lichaam kan stimuleren. Het is snel. De injecties duren minder dan 10 minuten om te voltooien, en of en waar een reporter-gen tot expressie komt, is binnen enkele dagen na het verzamelen van monsters te zien.Als u wilt beginnen met klonen, kiest of ontwerpt u een reporterconstructie. De hier gebruikte constructie plaatst de enhancer-kandidaat in het drie belangrijkste onvertaalde gebied van een EGFP-reportergen dat tot expressie komt onder controle van de minimale hsp68-promotor. Om de PCR-primers te ontwerpen voor het versterken van een reeks van interesses en klonen in de vector, voegt u de juiste homologiearm voor Gibson-klonen toe aan het vijf priemeinde van de primers.Voer met behulp van de ontworpen primers PCR uit een DNA-monster uit. Verwerk één tot 10 microgram vector-DNA met Pac1 en Asc1, afhankelijk van het gewenste aantal vereiste kloonreacties. Door 0,7 tot 1% gel-elektroforese gedurende 30 tot 60 minuten bij 100 volt te gebruiken, scheidt u de restrictie-digestfragmenten.Extraheer de band voor de gelineariseerde vector en zuiver deze met een commerciële gelextractiekit. Zodra het Gibson klonen en transformeren van cellen is voltooid, plaatst u de cellen op selectieve media en incubeert u 's nachts bij 37 graden Celsius. Na verificatie van het succesvol klonen van de reporterconstructie, ent u vijf milliliter van de startercultuur met behulp van de glycerolvoorraad.Kweek de kweek gedurende acht tot 16 uur in een schuddende incubator bij 30 graden Celsius en 180 rotaties per minuut. Terwijl de bouillon troebel wordt, verdunt u de startercultuur 1.000x in 250 tot 300 milliliter verse selectieve LB-bouillon en incubeert u deze een nacht in een schuddende incubator bij 30 graden Celsius en 180 rotaties per minuut. Gebruik een commerciële plasmide maxi kit om het plasmide te zuiveren.Om te testen op de recombinatie van de ITR's, voert u een Xma1-vertering uit. Visualiseer de banden. Zorg ervoor dat je digest het verwachte aantal banden weergeeft.Recombinatie zal resulteren in minder dan verwachte banden. Bereid recombinant AAV-mengsel voor levering. Als u de expressiepatronen van meerdere enhancer reporter-virussen vergelijkt, verdunt u elk virus om de virustiters gelijk te stellen aan het minst geconcentreerde virus.Meng het enhancer reporter-virus en constitutief uitgedrukt controlerapportervirus in een verhouding van twee tot één of drie op één. Voeg een kleine hoeveelheid snelle groene kleurstof toe met een uiteindelijke concentratie van 0,06% Breek de punt van een getrokken glazen pipet gemaakt van een microliter-gegradueerde capillaire buis door deze voorzichtig in een delicaat, pluisvrij doekje te prikken. Plaats de pipet in een aspiratorassemblage met een drukapparaat dat is aangesloten op een rubberen pakking voor het vasthouden van een microcapillaire pipet.Trek een klein volume van ongeveer 0,2 tot 0,5 microliter minerale olie in de pipet door negatieve druk uit te oefenen door de aspirator. Houd de aspirator opzij en plaats het virus op ijs totdat het klaar is om te injecteren. Na cryo-anesthetische de neonatale muizen, oefent u negatieve druk uit met behulp van de aspiratorassemblage en trekt u het virusmengsel in de getrokken glazen pipet totdat de meniscus het vinkje van twee microliter passeert.Haal de muis uit de buurt van de koude kamer en plaats hem op de bovenkant van de bank. Lokaliseer de bilaterale injectieplaatsen halverwege tussen lambda en bregma, evenals de sagittale hechting en elk oog. Ontsmet ze met een alcoholdoekje.Prik de schedel van de neonatale muizen door met behulp van de getrokken glazen pipet. Als de naald de schedel binnendringt, oefent u een positieve druk uit door de aspiratorassemblage. Doseer één microliter van het virus in de laterale ventrikel en trek de pipet terug.Plaats de muis op een verwarmingskussen of een verwarmingskamer om te herstellen. Breng het dier terug naar de thuiskooi zodra het wakker is geworden. Neem fluorescentiebeelden op die het hersengedeelte overschrijden met behulp van een 5x subjectieve lens met lage vergroting.Door de injectieplaats te lokaliseren, evalueert u de mate van virustransductie, afhankelijk van de dichtheid en intensiteit van rode fluorescerende cellen. Vergelijk de dieren die op dezelfde manier werden getransduceerd. Neem fluorescerende beelden op met een lens met een hoger vergrotingsobjectief van meer dan 25x.Open vervolgens de analysesoftware en pas een mediaanfilter van drie bij drie toe om ruis te verminderen. Klik op het menu Proces, klik vervolgens op Ruis en kies de optie Despeckle. Als u vervolgens de achtergrondfluorescentie van de afbeeldingen wilt aftrekken, begint u met het scheiden van de kanalen van een meerkanaalsafbeelding.Klik op het menu Afbeelding, klik vervolgens op Kleur en selecteer de optie Kanalen splitsen. Teken met het gereedschap rechthoek of cirkelselectie een kleine vorm in een gebied van de afbeelding zonder fluorescerende cellen. Meet de gemiddelde pixelintensiteit van de achtergrond door op Analyseren en vervolgens Meten te klikken en herhaal om meerdere keren te samplen.Gemiddelde van de gemiddelde grijswaarde van vijf tot acht achtergrondgebieden en verlaag de decimale waarden. Trek de waarden van elke pixel in de afbeelding af door het menu Proces te selecteren en klik vervolgens op Wiskunde en aftrekken. Voer vervolgens de achtergrondwaarde in die u wilt aftrekken en klik op OK. Voeg indien nodig de kanalen weer samen tot een meerkanaalsafbeelding door het menu Afbeelding te selecteren, klik vervolgens op Kleur en selecteer Kanalen samenvoegen.Als u het aantal groene fluorescerende cellen wilt tellen, verbergt u het groene kanaal en tekent u een vorm rond het hersengebied die rode fluorescentie tot expressie brengt met behulp van het gereedschap voor het selecteren van vrije vorm. Klik op de functie Meten om het gebied, de geïntegreerde dichtheid en de gemiddelde grijswaarde van het rode kanaal in de geselecteerde zone te meten. Tel het aantal groene cellen met behulp van een meerpuntsselectietool en normaliseer het aantal groene cellen door de geïntegreerde intensiteit van het rode kanaal.Na het transduceren van de enhancer reporter dat de muis intracraniaal op P0 injecteerde met een positief AAV-construct vertoonde enhancer-gedreven EGFP-expressie in de middelste onderste lagen van de cortex 28 dagen na injectie. De muis geïnjecteerd met een negatief controleconstruct op P0 vertoont 28 dagen na injectie geen enkele expressie van EGFP, wat aantoont dat de enhancer-elementen de transcriptie van EGFP in de muizenhersenen blijken te stimuleren. Om het succesvol getransduceerde gebied en de controle op potentiële variabiliteit te visualiseren, werden AAV-geleverde enhancer reporter-bibliotheken van verschillende titers onderzocht.De hoge titerbibliotheek van kandidaat-versterkers stimuleert brede EGFP-expressie, terwijl de lagere titerbibliotheek van kandidaat-versterkers schaarse CGFP-expressie in het P7-muizenbrein stimuleert. Het is van vitaal belang om de enhancer reporter AAV te mengen met de positieve controle bij elke injectie om onderscheid te maken tussen versterkers zonder activiteit en mislukte leveringen. Deze procedure kan worden gecombineerd met immunohistochemie, RNA FISH of eencellige RNA-sequencing om te bepalen in welke celtypen een versterker actief is.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation Video (Video) | JoVE

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI Video (Video) | JoVE

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Zuivering van Mouse Brain Schepen

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...