Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

Die Sequenzierung wurde am UC Davis DNA Technologies Core durchgeführt. Wir danken dem Labor von Lin Tian an der UC Davis für die Schulung zu rAAV-Verpackungen und die großzügige Schenkung von AAV-Helfer- und Rep/Cap-Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH/NIGMS R35GM119831 unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #22339) und dem UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903) genehmigt. Dieses Protokoll wurde an C57BL/6J-Mäusen beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 0-1 getestet.
1. Klonen Sie die Enhancer-Kandidatensequenz in das AAV-Vektorplasmid.
HINWEIS: Die repräsentativen Protokolle sind angegeben, aber die Klonstrategie hat ein hohes Maß an Flexibilit?...

Dieses Protokoll beschreibt eine rAAV-basierte Methode für den Einsatz von Enhancer-getriebenen Transgenen im postnatalen Mausgehirn. In diesem verallgemeinerten Protokoll werden ein Kandidatenverstärker, ein minimaler Promotor, ein Reportergen und eine optionale Barcode-Sequenz in ein AAV-Plasmid-Rückgrat kloniert. Diese Experimente können mit einer einzelnen Kandidaten-Enhancer-Sequenz oder mit vielen parallelen Sequenzen durchgeführt werden. Das Plasmid wird in ein rAAV verpackt und an das postnatale Mausgehirn a...

Enhancer sind genomische cis-regulatorische Elemente, die als Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen dienen und die Expression eines Zielgens räumlich spezifisch vorantreiben können 1,2. Sie sind in verschiedenen Zelltypen, Geweben und Entwicklungsstadien unterschiedlich aktiv und können Substrate krankheitsrisikobedingter genomischer Variation sein 3,4. Daher ist die Notwendigkeit, die Dynamik der Enhancer-Funktion zu verstehen, entscheidend für den Fortschritt sowohl in translationalen als auch in grundlagenwissenschaftlichen Anwendungen innerhalb der Genomik. In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität können als hervorragende Ressourcen für die Erstellung von Hypothesen über die Enhancer-Fähigkeitdienen 5,6. Eine solche vorhergesagte Enhancer-Aktivität kann eine zusätzliche Validierung und Abfrage erfordern, um die funktionelle Aktivität vollständig zu verstehen. Enhancer-Reporter-Assays haben sich für diesen Zweck in einer Vielzahl von Systemen als wertvoll erwiesen, von Zellen bis hin zu Tieren 7,8,9. Um diese Studien in einem flexiblen und kostengünstigen transienten In-vivo-Kontext zu erweitern, beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von in vivo AAV-basierten Methoden, um mutmaßliche Enhancer-Sequenzen auf ihre Fähigkeit zu testen, die Expression eines ektopischen Reportergens im postnatalen Mausgehirn zu steuern. Diese Methodenfamilie eignet sich für die Abfrage einzelner Kandidatensequenzen oder das parallele Bibliotheksscreening und ist für die Grundlagen- und translationale Forschung relevant.
Diese Methode kombiniert in einem einzigen Plasmid eine mutmaßliche Enhancer-Kandidaten-DNA-Sequenz mit einem Reportergen (hier EGFP), unter der Kontrolle eines minimalen Promotors, der allein keine signifikante Expression antreibt. Das Plasmid wird in rekombinante AAV (rAAV) verpackt und in ein Tiermodell injiziert. Während die Anwendung hier auf das Gehirn gerichtet ist, ermöglichen verschiedene rAAV-Serotypen eine Infektion über verschiedene Gewebetypen hinweg, so dass dieser Ansatz auf andere Systeme ausgedehnt werden kann10. Nach einiger Zeit kann das Gehirn gesammelt und auf die Expression des Reportergens untersucht werden. Die starke Expression im Vergleich zu Kontrollen deutet darauf hin, dass die getestete Kandidatensequenz die Expression des Gens "verstärken" konnte (Abbildung 1). Dieses einfache Design bietet einen einfachen und klaren Ansatz, um eine Sequenz für die Enhancer-Aktivität in vivo im Gehirn zu testen.
Zusätzlich zum Testen der Enhancer-Fähigkeit einer Sequenz kann diese Methode mit Techniken zur Bestimmung der Zelltyp-Enhancer-Aktivität kombiniert werden. In sequenzbasierten Ansätzen zur Bestimmung der differentiellen Enhancer-Aktivität kann die Sortierung von Zellen nach zelltypspezifischen Markern vor der DNA- und RNA-Sequenzierung es Forschern ermöglichen, festzustellen, ob verschiedene Zelltypen differentielle Enhancer-Aktivität zeigen, wie in Gisselbrecht et al.11 beschrieben. In bildgebenden Ansätzen ermöglicht die Co-Markierung von Bildern mit zelltypspezifischen Markern die Untersuchung, ob Zellen mit Enhancer-getriebener Fluoreszenz auch Zelltypmarker von Interesse aufweisen 12,13,14,15,16. Enhancer-Reporter-Assays ermöglichen das direkte Testen der risikoassoziierten allelischen Variation von Enhancern auf Auswirkungen auf die Enhancer-Fähigkeit. Die überwiegende Mehrheit der in genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) identifizierten Risikoorte liegt in nicht-kodierenden Regionen des Genoms17. Funktionelle Annotationsstudien dieser Risikoorte deuten darauf hin, dass ein großer Teil wahrscheinlich als Verstärker wirkt18,19,20. Der MPRA-Einsatz in vivo kann es ermöglichen, diese risikoassoziierten Varianten auf Enhancer-Aktivität im Gehirnzu testen 12,21. Schließlich können Lieferung und Abholung zu unterschiedlichen Zeitpunkten Einblicke in die Entwicklungsphasen geben, in denen ein Enhancer aktiv ist.
Enhancer-Reporter-Plasmid-Designs sind vielfältig und können an experimentelle Ziele angepasst werden. Es gibt mehrere Optionen für minimale Promotoren, die in der Enhancer-Forschung verwendet wurden, wie der humane β-Globin-Minimalpromotor22 und der Maus-Hsp68-Minimalpromotor23. Es ist bekannt, dass diese Promotoren niedrige Expressionsniveaus antreiben, es sei denn, sie werden mit einem Enhancer-Element gekoppelt, um sie zu aktivieren. Im Gegensatz dazu treiben konstitutive Promotorelemente eine starke Expression des Transgens an, die für die Positivkontrolle oder zum Testen der Enhancer-Funktion vor dem Hintergrund einer robusten Expression nützlich ist. Übliche Optionen für konstitutive Promotoren sind CAG, ein Hybridpromotor, der aus dem Hühner-β-Aktin-Promotor und dem Cytomegalovirus-Immediate-Early Enhancer24 gewonnen wird, oder humanes EF1α25. Da bekannt ist, dass Enhancer bidirektional arbeiten26, sind die Ausrichtung und Position des Enhancers relativ zum minimalen Promotor flexibel (Abbildung 2A). Traditionelle Enhancer-Reporter-Assays platzieren den Enhancer vor dem Promotor und enthalten bei Bibliothekslieferungen eine Barcode-Sequenz stromabwärts des Reportergens, um Sequenzierungslesevorgänge mit dem getesteten Enhancer27 zu verknüpfen. Enhancer können aber auch im offenen Leserahmen des Reportergens platziert werden und als eigene Barcode-Sequenz dienen, wie es in STARR-seq28 der Fall ist. Das hier beschriebene Protokoll verwendet das STARR-seq-Assay-Design, wobei die Kandidaten-Enhancer-Sequenz in die 3'-UTR des Reportergens platziert wird. Während die STARR-seq-Orientierung den Vorteil einer schlankeren Klonierung bietet, ist sie weniger gut verstanden als der herkömmliche Ansatz und kann eine variable RNA-Stabilität zwischen Konstrukten induzieren. Die beschriebenen Methoden können leicht entweder an die STARR-seq oder die konventionelle Orientierung angepasst werden, mit geringfügigen Änderungen des Klonierungsprozesses, die an anderer Stelle27,29 beschrieben wurden.
Verschiedene Methoden der AAV-Verabreichung können verwendet werden, um diese Technik weiter an experimentelle Ziele anzupassen (Abbildung 2B). Direkte intrakranielle Injektionen, die in diesem Protokoll näher beschrieben werden, liefern eine hohe Viruskonzentration direkt an das Gehirn30. Dies ergibt eine hohe Transduktionseffizienz, die sich auf die Injektionsstelle konzentriert, was dies zu einer ausgezeichneten Technik für Experimente macht, die die Dichte transduzierter Zellen über einen Gewebebereich maximieren wollen. Stereotaktische Injektion kann dazu beitragen, die Injektionsstelle über Tiere hinweg zu standardisieren, um eine reproduzierbare lokalisierte Transduktion zu ermöglichen. Intrakranielle Injektionen sind bei frühen postnatalen Tieren am einfachsten. Als alternative Technik können systemische Injektionen Transgene unter Verwendung von AAVs mit Serotypen liefern, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schrankezu überwinden 31. Schwanzveneninjektionen ermöglichen es dem Virus, im ganzen Körper zu zirkulieren, was eine generalisierte Abgabe über viele Gewebe hinweg ermöglicht10. Retroorbitale Injektionen sind eine weitere systemische Injektionstechnik, die das Virus hinter dem Auge in den retroorbitalen Sinus32 liefert. Dies bietet einen direkteren Weg für das AAV vom Venensystem zum Gehirn, was zu einer höheren Konzentration von transduzierten Zellen im Gehirn führt als Injektionen in peripherere Blutgefäße33.
Ein weiterer flexibler Aspekt dieser Technik ist die Methode des Auslesens. Im Großen und Ganzen können Optionen als reporterbasiert oder sequenzierungsbasiert beschrieben werden (Abbildung 2C). Die Integration eines fluoreszierenden Reporters wie GFP in den offenen Leserahmen des Konstrukts führt zur Expression des fluoreszierenden Proteins in allen transduzierten Zellen, in denen der Kandidatenverstärker die Expression antreibt. Markierungs- und Bildgebungsverfahren wie die Immunhistochemie ermöglichen die Signalverstärkung. Sequenzierungsbasierte Auslesetechniken beinhalten die Identifizierung von Sequenzen aus dem gelieferten Konstrukt in RNA, die aus dem Gewebe gesammelt wurde. Durch die Quantifizierung der Menge an viraler DNA, die ursprünglich abgegeben wurde, kann der Vergleich der exprimierten RNA mit der gelieferten DNA verwendet werden, um zu bestimmen, inwieweit eine getestete Enhancer-Sequenz in der Lage war, eine erhöhte Expression des Transgens zu bewirken, beispielsweise im Rahmen eines massively parallel reporter assay (MPRA). MPRAs bieten eine leistungsstarke Erweiterung dieser Techniken, um bis zu Tausende von Kandidaten-Enhancern gleichzeitig auf Aktivität zu testen und wurden in der Genomforschungausführlich beschrieben 12,27,34,35,36. Ein höheres Durchsatz-Screening wird durch die Ausführung von Klonierungs-, Verpackungs-, Liefer- und Sequenzierungsschritten für Kandidatenverstärker im Batch und nicht einzeln erreicht.
Die Auswahl von Kandidatenverstärkern bietet eine weitere Möglichkeit zur Flexibilität (Abbildung 2D). Mit diesem Assay können beispielsweise Enhancer eines bestimmten Gens identifiziert, die Funktion nicht-kodierender DNA-Regionen von Interesse ermittelt oder bestimmte Zelltypen oder Entwicklungsstadien bestimmt werden, in denen ein Enhancer aktiv ist - all dies dient Zielen sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Krankheitsforschung. Im Allgemeinen wird die Auswahl von Kandidatenverstärkern durch In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität bestimmt. Im Allgemeinen beinhalten In-silico-Vorhersagen ChIP-seq für Histonmodifikationen, die auf wahrscheinliche Enhancer hinweisen, wie H3K27ac37 und Chromatin-Zugänglichkeitskartierung38. Schließlich ist ein wachsendes Forschungsgebiet das funktionsbasierte Screening synthetisch gestalteter Enhancer-Elemente, das Studien darüber ermöglicht, wie die Enhancer-Sequenz die Funktion39 steuert, und das Design von Enhancern mit spezifischen Eigenschaften40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Enhancer sind Bindungsplattformen für eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren, die spezifische Expressionsmuster von gewebe- und zelltypspezifischen Genen steuern. Mehrere Methoden zur Beurteilung nicht-kodierender DNA und verschiedener Chromatinzustände haben sich bei der Vorhersage des Vorhandenseins von Enhancer-Sequenzen im Genom als nützlich erwiesen, aber die Validierung der Aktivität dieser Sequenzen und das Finden der Organe und Entwicklungsstadien, in denen sie aktiv sind, ist ein arbeitsintensiver Prozess. Jüngste Fortschritte bei Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) haben die weit verbreitete Abgabe von Transgenen an Mausgewebe ermöglicht, was In-vivo-Enhancer-Tests ermöglicht, ohne dass ein transgenes Tier erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, wie ein Reporterkonstrukt, das EGFP unter der Kontrolle eines minimalen Promotors exprimiert, der selbst keine signifikante Expression antreibt, verwendet werden kann, um die Aktivitätsmuster von Kandidaten-Enhancer-Sequenzen im Mausgehirn zu untersuchen. Ein AAV-verpacktes Reporterkonstrukt wird an das Mausgehirn abgegeben und für 1-4 Wochen inkubiert, danach wird das Tier geopfert und Gehirnabschnitte werden unter einem Mikroskop beobachtet. EGFP tritt in Zellen auf, in denen der getestete Enhancer ausreicht, um die Genexpression zu initiieren und den Ort und das Entwicklungsstadium zu bestimmen, in dem der Enhancer im Gehirn aktiv ist. Standard-Klonierungsmethoden, kostengünstige AAV-Verpackungen und expandierende AAV-Serotypen und Methoden für die In-vivo-Verabreichung und Standard-Bildgebungsauslesung machen dies zu einem zugänglichen Ansatz für die Untersuchung, wie die Genexpression im Gehirn reguliert wird.

Mit diesen Methoden wurde eine 915 bp-Sequenz im psychiatrischen risikoassoziierten dritten Intron des Gens CACNA1C19,49,50 auf Enhancer-Aktivität im postnatalen Mausgehirn getestet. Diese Sequenz wurde in einer MPRA von 345 Kandidaten-Enhancer-Sequenzen entdeckt, die sich auf psychiatrische und neurologische Risiko-SNPs12 konzentrieren, und Charakterisierungsexperimente werden hier als allgemei...

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AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen rAAV-basierten transienten Enhancer-Reporter-Assay. Dieser Assay kann verwendet werden, um eine enhancergesteuerte Expression in vivo im Gehirn der Maus zu induzieren.

AAV-Einsatz von Enhancer-basierten Expressionskonstrukten in vivo im Gehirn von Mäusen

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Dieses Protokoll ist wichtig, da es nicht nur die Visualisierung ermöglicht, ob eine Enhancer-Sequenz die Expression steuern kann, sondern auch, wo sie die Expression in einem bestimmten Teil des Körpers steuern kann. Es ist schnell. Die Injektionen dauern weniger als 10 Minuten, und ob und wo ein Reportergen exprimiert wird, kann innerhalb weniger Tage nach der Probenentnahme gesehen werden.Um mit dem Klonen zu beginnen, wählen oder entwerfen Sie ein Reporterkonstrukt. Das hier verwendete Konstrukt platziert den Enhancer-Kandidaten in die drei wichtigsten untranslatierten Regionen eines EGFP-Reportergens, das unter der Kontrolle des hsp68-Minimalpromotors exprimiert wird. Um die PCR-Primer für die Amplifikation einer Sequenz von Interesse und das Klonen in den Vektor zu entwerfen, fügen Sie den entsprechenden Homologiearm für die Gibson-Klonierung an das fünf Primzahlende der Primer hinzu.Führen Sie mit den entwickelten Primern eine PCR aus einer DNA-Probe durch. Verdauen Sie ein bis 10 Mikrogramm Vektor-DNA mit Pac1 und Asc1, abhängig von der gewünschten Anzahl der erforderlichen Klonreaktionen. Durch Verwendung von 0,7 bis 1% Gelelektrophorese für 30 bis 60 Minuten bei 100 Volt trennen Sie die Restriktionsdigest-Fragmente.Extrahieren Sie das Band für den linearisierten Vektor und reinigen Sie es mit einem handelsüblichen Gelextraktionskit. Sobald das Gibson-Klonen und die Transformation der Zellen abgeschlossen sind, werden die Zellen auf selektiven Medien beschichtet und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nachdem Sie das erfolgreiche Klonen des Reporterkonstrukts überprüft haben, impfen Sie fünf Milliliter der Starterkultur mit dem Glycerinvorrat.Züchten Sie die Kultur für acht bis 16 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 180 Umdrehungen pro Minute. Wenn die Brühe trüb wird, verdünnen Sie die Starterkultur 1.000x in 250 bis 300 Milliliter frischer selektiver LB-Brühe und inkubieren Sie sie über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 180 Umdrehungen pro Minute. Reinigen Sie das Plasmid mit einem handelsüblichen Plasmid-Maxi-Kit.Um die Rekombination der ITRs zu testen, führen Sie eine Xma1-Verdauung durch. Visualisieren Sie die Bänder. Stellen Sie sicher, dass Ihr Digest die erwartete Anzahl von Bändern anzeigt.Die Rekombination führt zu weniger Bändern als erwartet. Rekombinante AAV-Mischung für die Lieferung vorbereiten. Wenn Sie die Expressionsmuster mehrerer Enhancer-Reporterviren vergleichen, verdünnen Sie jedes Virus, um die Virustiter mit dem am wenigsten konzentrierten Virus gleichzusetzen.Mischen Sie das Enhancer-Reportervirus und das konstitutiv ausgedrückte Kontrollreportervirus in einem Verhältnis von zwei zu eins oder drei zu eins. Fügen Sie eine kleine Menge schnellen grünen Farbstoff mit einer Endkonzentration von 0,06% hinzuBrechen Sie die Spitze einer gezogenen Glaspipette aus einem Mikroliter-Kapillarrohr, indem Sie sie vorsichtig in ein zartes, fusselfreies Tuch stechen. Führen Sie die Pipette in eine Absaugvorrichtung mit einer Druckansaugvorrichtung ein, die mit einer Gummidichtung zur Aufnahme einer Mikrokapillarpipette verbunden ist.Ziehen Sie ein kleines Volumen von etwa 0,2 bis 0,5 Mikrolitern Mineralöl in die Pipette, indem Sie Unterdruck durch den Absauger anlegen. Halten Sie die Absaugeinheit beiseite und legen Sie das Virus auf Eis, bis es zur Injektion bereit ist. Nach der Kryoanästhesie der Neugeborenenmäuse Unterdruck mit der Aspiratoranordnung anlegen und die Virusmischung in die gezogene Glaspipette ziehen, bis der Meniskus die Zwei-Mikroliter-Häkchenmarke passiert.Nehmen Sie die Maus aus der Kältekammer und legen Sie sie auf die Tischplatte. Lokalisieren Sie die bilateralen Injektionsstellen auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma sowie die sagittale Naht und jedes Auge. Desinfizieren Sie sie mit einem Alkoholtuch.Durchbohren Sie den Schädel der neugeborenen Mäuse mit der gezogenen Glaspipette. Wenn die Nadel in den Schädel eindringt, üben Sie einen positiven Druck durch die Absaugeinheit aus. Geben Sie einen Mikroliter des Virus in den lateralen Ventrikel und ziehen Sie die Pipette zurück.Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine Wärmekammer, um sich zu erholen. Bringen Sie das Tier nach dem Erwachen in den heimischen Käfig zurück. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder auf, die den Gehirnabschnitt mit einer 5-fachen subjektiven Linse mit geringer Vergrößerung durchqueren.Durch die Lokalisierung der Injektionsstelle ist das Ausmaß der Virustransduktion in Abhängigkeit von der Dichte und Intensität der rot fluoreszierenden Zellen zu bewerten. Vergleichen Sie die Tiere, die ähnlich übertragen wurden. Nehmen Sie fluoreszierende Bilder mit einem Objektivobjektiv mit höherer Vergrößerung von mehr als 25x auf.Öffnen Sie als Nächstes die Analysesoftware und wenden Sie einen Drei-mal-Drei-Medianfilter an, um das Rauschen zu reduzieren. Klicken Sie auf das Menü Verarbeiten, dann auf Rauschen und wählen Sie die Option Flecken entfernen. Um die Hintergrundfluoreszenz von den Bildern zu subtrahieren, trennen Sie zunächst die Kanäle eines Mehrkanalbildes.Klicken Sie auf das Menü Bild, dann auf Farbe und wählen Sie die Option Kanäle teilen. Zeichnen Sie mit dem Rechteck- oder Kreisauswahlwerkzeug eine kleine Form in einem Bereich des Bildes ohne fluoreszierende Zellen. Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität des Hintergrunds, indem Sie auf Analysieren und dann auf Messen klicken, und wiederholen Sie den Vorgang mehrmals.Mittelwert des mittleren Grauwerts von fünf auf acht Hintergrundbereiche, und entfernen Sie die Dezimalwerte. Subtrahieren Sie die Werte von jedem Pixel im Bild, indem Sie das Menü "Verarbeiten" auswählen und dann auf "Mathematik" und "Subtrahieren" klicken. Geben Sie als Nächstes den zu subtrahierenden Hintergrundwert ein und klicken Sie auf OK. Falls erforderlich, fügen Sie die Kanäle wieder zu einem Mehrkanalbild zusammen, indem Sie das Menü Bild auswählen, dann auf Farbe klicken und Kanäle zusammenführen auswählen.Um die Anzahl der grün fluoreszierenden Zellen zu zählen, blenden Sie den grünen Kanal aus und zeichnen Sie mit dem Freiform-Auswahlwerkzeug eine Form um die Gehirnregion, die rote Fluoreszenz ausdrückt. Klicken Sie auf die Funktion Messen, um die Fläche, die integrierte Dichte und den mittleren Grauwert des Rotkanals in der ausgewählten Zone zu messen. Zählen Sie die Anzahl der grünen Zellen mithilfe eines Mehrpunktauswahlwerkzeugs, und normalisieren Sie die Anzahl der grünen Felder um die integrierte Intensität des roten Kanals.Nach dem Transducing des Enhancer-Reporters zeigte die intrakranielle Injektion der Maus bei P0 mit einem positiven AAV-Konstrukt eine enhancergetriebene EGFP-Expression in den mittleren unteren Schichten des Kortex 28 Tage nach der Injektion. Die Maus, der ein Negativkontrollkonstrukt bei P0 injiziert wurde, zeigte 28 Tage nach der Injektion keine Expression von EGFP, was zeigt, dass die Enhancer-Elemente die Transkription von EGFP im Gehirn der Maus vorantreiben. Um den erfolgreich übertragenen Bereich zu visualisieren und auf potenzielle Variabilität zu kontrollieren, wurden AAV-gelieferte Enhancer-Reporterbibliotheken verschiedener Titer untersucht.Die High-Titer-Bibliothek der Kandidaten-Enhancer treibt eine breite EGFP-Expression an, während die Low-Titer-Bibliothek der Kandidaten-Enhancer die spärliche CGFP-Expression im P7-Mausgehirn antreibt. Es ist wichtig, den Enhancer-Reporter AAV mit der Positivkontrolle bei jeder Injektion zu mischen, um zwischen Enhancern ohne Aktivität und fehlgeschlagenen Lieferungen zu unterscheiden. Dieses Verfahren kann mit Immunhistochemie, RNA-FISH oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung kombiniert werden, um zu bestimmen, in welchen Zelltypen ein Enhancer aktiv ist.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Gezielte Expression von optogenetische Proteinen mit Seide/AAV Filme

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Ein Rattenmodell der EcoHIV-Gehirninfektion

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...