Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

הריצוף בוצע בליבת טכנולוגיות הדנ"א של אוניברסיטת קליפורניה בדייוויס. אנו מודים למעבדה של לין טיאן באוניברסיטת קליפורניה בדייוויס על ההכשרה על אריזות rAAV והעניקה לנו בנדיבות עוזר AAV ופלסמידים של נציג / כובע. עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIGMS R35GM119831.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UC Davis (פרוטוקול #22339) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של UC Davis (BUA-R1903). פרוטוקול זה נבדק על עכברי C57BL/6J משני המינים ביום שלאחר הלידה 0-1.
1. שכפלו את רצף המועמדים המשפרים לפלסמיד הווקטורי AAV.
...

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת rAAV לפריסת טרנסגנים מונעי משפר במוח העכבר שלאחר הלידה. בפרוטוקול כללי זה, משפר מועמדים, מקדם מינימלי, גן מדווח ורצף ברקוד אופציונלי משוכפלים לתוך עמוד שדרה פלסמיד AAV. ניסויים אלה יכולים להיעשות עם רצף משפר מועמד יחיד או עם רצפים רבים במקביל. הפלסמיד נארז לתוך rAAV ?...

משפרים הם אלמנטים גנומיים של ויסות ציס-רגולטורי המשמשים כאתרי קשירה של גורמי שעתוק ויכולים להניע את הביטוי של גן מטרה באופן ספציפי מרחבית 1,2. הם פעילים באופן דיפרנציאלי בסוגי תאים, רקמות ושלבי התפתחות שונים ויכולים להיות מצעים של וריאציה גנומית הקשורה לסיכון למחלות 3,4. לפיכך, הצורך להבין את הדינמיקה של תפקוד המשפר הוא קריטי להתקדמות הן ביישומים תרגומיים והן ביישומים מדעיים בסיסיים בגנומיקה. בסיליקו תחזיות של פעילות משפר יכולות לשמש משאבים מצוינים ליצירת השערות לגבי יכולת שיפור 5,6. פעילות משפרת חזויה כזו יכולה לדרוש תיקוף וחקירה נוספים להבנה מלאה של הפעילות התפקודית. מבחני כתבים משפרים הוכיחו את עצמם כבעלי ערך למטרה זו במגוון מערכות, מתאים ועד בעלי חיים 7,8,9. לקראת הרחבת מחקרים אלה בהקשר גמיש וחסכוני של in vivo, פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיטות מבוססות in vivo AAV לבדיקת רצפי משפר פוטטיביים על יכולתם להניע את הביטוי של גן מדווח חוץ רחמי במוח העכבר שלאחר הלידה. למשפחה זו של שיטות יש תועלת בחקירת רצפי מועמדים בודדים או סינון ספרייה מקביל והיא רלוונטית למחקר בסיסי ותרגומי.
שיטה זו משלבת בפלסמיד יחיד רצף דנ"א מועמד לשיפור פוטטיבי עם גן מדווח (כאן EGFP), תחת שליטתו של מקדם מינימלי שאינו מניע ביטוי משמעותי. הפלסמיד נארז לתוך AAV רקומביננטי (rAAV) ומוזרק למודל של בעלי חיים. בעוד היישום כאן הוא על המוח, סרוטיפים שונים של rAAV מאפשרים זיהום על פני סוגי רקמות שונים, כך שניתן להרחיב גישה זו למערכות אחרות10. לאחר פרק זמן מסוים, ניתן לאסוף את המוח ולבדוק את הביטוי של הגן המדווח. ביטוי חזק, בהשוואה לבקרות, מצביע על כך שרצף המועמדים שנבדקו הצליח "לשפר" את ביטוי הגן (איור 1). עיצוב פשוט זה מציע גישה קלה וברורה לבדיקת רצף של פעילות משפרת in vivo במוח.
בנוסף לבדיקת יכולת השיפור של רצף, ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות לקביעת פעילות משפר מסוג תא. בגישות מבוססות רצף לקביעת פעילות משפרת דיפרנציאלית, מיון תאים על סמנים ספציפיים לסוג התא לפני ריצוף דנ"א ורנ"א יכול לאפשר לחוקרים לקבוע אם סוגי תאים שונים מראים פעילות משפרת דיפרנציאלית, כפי שתואר ב- Gisselbrecht et al.11. בגישות מבוססות הדמיה, תיוג משותף של תמונות עם סמנים ספציפיים לסוג תא מאפשר לבחון אם תאים המציגים פלואורסצנציה מונעת משפר מציגים גם סמנים מסוג תא בעלי עניין 12,13,14,15,16. מבחני כתב משפר מאפשרים בדיקה ישירה של שונות אלילית הקשורה לסיכון במשפרים להשפעות על יכולת המשפר. הרוב המכריע של מוקדי הסיכון שזוהו במחקרי אסוציאציה כלל-גנומית (GWAS) נמצאים באזורים שאינם מקודדים בגנום17. מחקרי ביאור פונקציונליים של מוקדי סיכון אלה מצביעים על כך שחלק גדול ככל הנראה פועלים כמשפרים18,19,20. פריסת MPRA in vivo יכולה לאפשר בדיקה של גרסאות אלה הקשורות לסיכון לפעילות משפרת במוח12,21. לבסוף, משלוח ואיסוף בנקודות זמן שונות יכולים להציע תובנות לגבי השלבים ההתפתחותיים שבמהלכם פעיל המשפר.
עיצובי פלסמידים משפרים-כתבים הם מגוונים וניתן להתאים אותם אישית כך שיתאימו למטרות הניסוי. ישנן מספר אפשרויות עבור מקדמים מינימליים ששימשו במחקר משפר, כגון מקדם מינימלי β-גלובין אנושי22 ועכבר Hsp68 מקדם מינימלי23. מקדמים אלה ידועים כמניעים רמות נמוכות של ביטוי, אלא אם כן הם משולבים עם אלמנט משפר כדי להפעיל אותם. לעומת זאת, אלמנטים מקדימים מכוננים מניעים ביטוי חזק של הטרנסגן, שימושי לשליטה חיובית או לבדיקת תפקוד משפר על רקע ביטוי חזק. אפשרויות נפוצות עבור מקדמים מכוננים כוללות CAG, מקדם היברידי המופק ממקדם β-אקטין עוף ומשפר ציטומגלווירוסמיידי 24, או EF1α25 אנושי. מאחר שידוע שמשפרים פועלים באופן דו-כיווני26, הכיוון והמיקום של המשפר ביחס למקדם המינימלי הם גמישים (איור 2A). מבחני משפר-כתב מסורתיים ממקמים את המשפר במעלה הזרם של המקדם, ובמשלוחי ספרייה, כוללים רצף ברקוד במורד הזרם של הגן המדווח כדי לשייך קריאות ריצוף עם המשפרהנבדק 27. עם זאת, משפרים יכולים גם להיות ממוקמים במסגרת הקריאה הפתוחה של הגן המדווח ולשמש כרצף ברקוד משלהם, כפי שנעשה ב- STARR-seq28. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתכנון הבדיקה STARR-seq, ומכניס את רצף משפר המועמדים לתוך 3' UTR של הגן המדווח. בעוד שהאוריינטציה STARR-seq מציעה את היתרון של שיבוט יעיל יותר, היא פחות מובנת מהגישה הקונבנציונלית ועשויה לגרום ליציבות RNA משתנה בין מבנים. ניתן להתאים בקלות את השיטות המתוארות לכיוון STARR-seq או קונבנציונלי עם שינויים קלים בתהליך השיבוט שתוארו במקום אחר27,29.
ניתן להשתמש בשיטות שונות של אספקת AAV כדי להתאים אישית עוד יותר את הטכניקה הזו כך שתתאים למטרות הניסוי (איור 2B). זריקות תוך גולגולתיות ישירות, המתוארות בהרחבה בפרוטוקול זה, מספקות ריכוז גבוה של הנגיף ישירות למוח30. זה נותן יעילות התמרה גבוהה המרוכזת באתר ההזרקה, מה שהופך את זה לטכניקה מצוינת לניסויים המבקשים למקסם את הצפיפות של תאים מתמרים על פני אזור של רקמה. הזרקה סטריאוטקטית יכולה לעזור לתקנן את אתר ההזרקה על פני בעלי חיים לצורך התמרה מקומית הניתנת לשחזור. זריקות תוך גולגולתיות הן הפשוטות ביותר בבעלי חיים מוקדמים לאחר הלידה. כטכניקה חלופית, זריקות סיסטמיות יכולות להעביר טרנסגנים באמצעות AAVs עם סרוטיפים המסוגלים לחצות את מחסום הדם-מוח31. זריקות לווריד הזנב מאפשרות לנגיף להסתובב בכל הגוף, ומאפשרות העברה כללית על פני רקמות רבות10. זריקות רטרו-אורביטליות הן טכניקת הזרקה מערכתית נוספת המעבירה את הנגיף מאחורי העין לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי32. זה מציע מסלול ישיר יותר עבור AAV מהמערכת הוורידית למוח, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה יותר של תאים מתמרים במוח מאשר זריקות לתוך כלי דם היקפיים יותר33.
היבט גמיש נוסף של טכניקה זו הוא שיטת הקריאה. באופן כללי, ניתן לתאר אפשרויות כמבוססות דיווח או מבוססות רצף (איור 2C). שילוב כתב פלואורסצנטי כגון GFP במסגרת הקריאה הפתוחה של המבנה מביא לביטוי של החלבון הפלואורסצנטי בכל התאים המתמרים שבהם המשפר המועמד הניע ביטוי. טכניקות תיוג והדמיה כגון אימונוהיסטוכימיה מאפשרות הגברת אותות. טכניקות קריאה מבוססות ריצוף כוללות זיהוי רצפים מהמבנה המועבר ב-RNA שנאסף מהרקמה. על ידי כימות כמות הדנ"א הנגיפי שנמסר בתחילה, ניתן להשתמש בהשוואה של רנ"א מבוטא לעומת דנ"א מועבר כדי לקבוע את המידה שבה רצף משפר שנבדק היה מסוגל להניע ביטוי מוגבר של הטרנסגן, למשל, בהקשר של בדיקת כתב מקבילה מסיבית (MPRA). MPRAs מציעים הרחבה רבת עוצמה של טכניקות אלה כדי לבדוק עד אלפי משפרים מועמדים לפעילות בו זמנית ותוארו בהרחבה במחקר גנומי 12,27,34,35,36. סינון תפוקה גבוה יותר מושג על ידי ביצוע שלבי שיבוט, אריזה, מסירה ורצף עבור משפרי מועמדים באצווה ולא בנפרד.
בחירת משפר מועמדים מספקת הזדמנות נוספת לגמישות (איור 2D). לדוגמה, בדיקה זו יכולה לשמש לזיהוי משפרים של גן מסוים, כדי לוודא את תפקודם של אזורי עניין ב- DNA שאינם מקודדים, או כדי לקבוע סוגי תאים ספציפיים או שלבים התפתחותיים שבמהלכם פעיל משפר - כל אלה משרתים מטרות הן במדע בסיסי והן בחקר מחלות. באופן כללי, בחירת משפר מועמדים מונעת על ידי תחזיות סיליקו של פעילות המשפר. בדרך כלל, תחזיות סיליקו כוללות ChIP-seq עבור שינויים היסטון המצביעים על משפרים אפשריים, כגון H3K27ac37 ומיפוי נגישות כרומטין38. לבסוף, תחום מחקר הולך וגדל הוא סינון מבוסס פונקציה של אלמנטים משפרים שתוכננו באופן סינתטי, המאפשר מחקרים על האופן שבו רצף משפר מכוון את פונקציה39 ותכנון של משפרים עם תכונות ספציפיות40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

משפרים הם פלטפורמות קשירה למגוון רחב של גורמי שעתוק המניעים דפוסי ביטוי ספציפיים של גנים ספציפיים לרקמות ולתאים. אמצעים מרובים להערכת דנ"א שאינו מקודד ומצבי כרומטין שונים הוכחו כיעילים בניבוי נוכחותם של רצפי משפרים בגנום, אך אימות הפעילות של רצפים אלה ומציאת האיברים ושלבי ההתפתחות שבהם הם פעילים הוא תהליך עתיר עבודה. ההתקדמות האחרונה בווקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) אפשרה העברה נרחבת של טרנסגנים לרקמות עכבר, מה שאפשר בדיקות משפר in vivo מבלי להזדקק לבעל חיים מהונדס. פרוטוקול זה מראה כיצד מבנה כתב המבטא EGFP תחת שליטתו של מקדם מינימלי, שאינו מניע ביטוי משמעותי בפני עצמו, יכול לשמש כדי לחקור את דפוסי הפעילות של רצפי משפר מועמדים במוח העכבר. מבנה כתב ארוז AAV מועבר למוח העכבר ודוגר במשך 1-4 שבועות, ולאחר מכן החיה מוקרבה, וקטעי מוח נצפים תחת מיקרוסקופ. EGFP מופיע בתאים שבהם המשפר הנבדק מספיק כדי ליזום ביטוי גנים, תוך ציון המיקום והשלב ההתפתחותי שבו המשפר פעיל במוח. שיטות שיבוט סטנדרטיות, אריזות AAV בעלות נמוכה והרחבת הסרוטיפים והשיטות של AAV להעברת in vivo וקריאת הדמיה סטנדרטית הופכים גישה זו לגישה נגישה לחקר האופן שבו ביטוי גנים מווסת במוח.

באמצעות שיטות אלה, רצף של 915 bp באינטרון השלישי הקשור לסיכון פסיכיאטרי של הגן CACNA1C19,49,50 נבדק לפעילות משפרת במוח העכבר שלאחר הלידה. רצף זה התגלה ב-MPRA של 345 רצפי משפר מועמדים שבמרכזם סיכון פסיכיאטרי ונוירולוגי SNPs12 וניסויי אפי...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

פרוטוקול זה מתאר בדיקה חדשנית של משפר-כתב ארעי המבוססת על rAAV. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לגרום לביטוי המונע על ידי משפר in vivo במוח העכבר.

פריסת AAV של מבני ביטוי מבוססי משפר in vivo במוח עכבר

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מאפשר הדמיה לא רק אם רצף משפר יכול להניע ביטוי, אלא היכן הוא יכול להניע ביטוי בחלק מסוים של הגוף. זה מהיר. ההזרקות נמשכות פחות מ-10 דקות, והאם והיכן מתבטא גן מדווח ניתן לראות תוך ימים ספורים בלבד מאיסוף הדגימה.כדי להתחיל את השיבוט, בחר או עצב מבנה של כתב. המבנה המשמש כאן ממקם את מועמד המשפר בשלושת האזורים הראשוניים הלא מתורגמים של גן כתב EGFP המתבטא תחת שליטתו של מקדם המינימום hsp68. כדי לתכנן את פריימרי ה-PCR להגברת רצף של עניין ושיבוט לתוך הווקטור, הוסיפו את זרוע ההומולוגיה המתאימה לשיבוט גיבסון לחמשת הקצוות הראשוניים של הפריימרים.באמצעות הפריימרים המתוכננים, בצע PCR מדגימת DNA. לעכל 1 עד 10 מיקרוגרם של דנ"א וקטורי באמצעות Pac1 ו- Asc1, בהתאם למספר הרצוי של תגובות השיבוט הנדרשות. על ידי שימוש באלקטרופורזה של 0.7 עד 1% ג'ל למשך 30 עד 60 דקות ב-100 וולט, יש להפריד את שברי ההגבלה.חלצו את הרצועה עבור הווקטור הליניארי, וטהרו אותה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרית. לאחר השלמת השיבוט והטרנספורמציה של התאים על ידי גיבסון, צלחת את התאים על מדיה סלקטיבית, ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר אימות השיבוט המוצלח של מבנה הכתב, יש לחסן חמישה מיליליטרים של תרבית המתנע באמצעות מלאי הגליצרול.לגדל את התרבית במשך שמונה עד 16 שעות באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-180 סיבובים לדקה. כאשר המרק הופך מעונן, לדלל את תרבית המתנע 1, 000x ב 250 עד 300 מיליליטר של מרק LB סלקטיבי טרי, ולדגור אותו לילה באינקובטור רועד ב 30 מעלות צלזיוס ו 180 סיבובים לדקה. באמצעות ערכת פלסמיד מקסי מסחרית, טהרו את הפלסמיד.כדי לבדוק את הרקומבינציה של ה- ITR, בצע עיכול Xma1. דמיינו את הלהקות. ודא שהתקציר שלך מציג את מספר הרצועות הצפוי.רקומבינציה תביא לפחות להקות מהצפוי. הכינו תערובת רקומביננטית AAV למשלוח. אם משווים את דפוסי הביטוי של מספר וירוסים משפרים, דיללו כל וירוס כדי להשוות את הווירוס לנגיף הכי פחות מרוכז.ערבבו את נגיף המדווח המשפר ואת נגיף המדווח המבוטאת באופן מכונן ביחס של שניים לאחד או שלושה לאחד. הוסיפו כמות קטנה של צבע ירוק מהיר בריכוז סופי של 0.06% שברו את קצהו של פיפטה מזכוכית משוכה העשויה מצינורית נימים בגימור מיקרוליטר על ידי ניקוב עדין למגבון עדין ונטול מוך. הכנס את הפיפטה למכלול אספירטור עם מכשיר להפעלת לחץ המחובר לאטם גומי להחזקת פיפטה מיקרו-קפילרית.למשוך נפח קטן של כ 0.2 עד 0.5 microliters של שמן מינרלי לתוך פיפטה על ידי הפעלת לחץ שלילי דרך השואף. שומרים את מכלול השואף בצד, ומניחים את הנגיף על הקרח עד שהוא מוכן להזרקה. לאחר הרדמת הקריו-הרדמה של עכברי היילודים, הפעילו לחץ שלילי באמצעות מכלול השואף, ומשכו את תערובת הנגיף לתוך פיפטה הזכוכית הנמשכת עד שהמניסקוס עובר את סימן הקרציות של שני מיקרוליטר.קח את העכבר הרחק מהתא הקר, והנח אותו על הספסל. אתר את אתרי ההזרקה הדו-צדדיים באמצע הדרך בין למבדה לברגמה, כמו גם את התפר הסגיטלי וכל עין. יש לחטא אותם באמצעות מגבון אלכוהול.לנקב את גולגולתם של עכברי היילודים באמצעות פיפטה הזכוכית הנמשכת. כאשר המחט נכנסת לגולגולת, הפעל לחץ חיובי דרך מכלול השואף. מוציאים מיקרוליטר אחד של הנגיף לחדר הצדדי, ומושכים את הפיפטה.הניחו את העכבר על כרית חימום או על תא חימום כדי להתאושש. החזירו את החיה לכלוב הביתי לאחר שהתעוררה. הקלט תמונות פלואורסצנטיות החוצות את מקטע המוח באמצעות עדשה סובייקטיבית 5x בהגדלה נמוכה.על ידי איתור אתר ההזרקה, להעריך את היקף התמרת הנגיף, בהתאם לצפיפות ולעוצמה של תאים פלואורסצנטיים אדומים. השווה את בעלי החיים שהותמרו באופן דומה. הקלט תמונות פלואורסצנטיות עם עדשה אובייקטיבית להגדלה גבוהה יותר של יותר מפי 25.לאחר מכן, פתח את תוכנת הניתוח, והחל מסנן חציוני של שלושה על שלושה כדי להפחית את הרעש. לחץ על תהליך בתפריט ולאחר מכן לחץ על רעש, ובחר באפשרות Despeckle. לאחר מכן, כדי להחסיר את פלואורסצנציית הרקע מהתמונות, התחילו בהפרדת הערוצים של תמונה רב-ערוצית.לחץ על תמונה בתפריט ולאחר מכן לחץ על צבע ובחר באפשרות פצל ערוצים. בעזרת הכלי מלבן או עיגול, ציירו צורה קטנה באזור בתמונה ללא תאים פלואורסצנטיים. מדוד את עוצמת הפיקסלים הממוצעת של הרקע על ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן מדוד, וחזור על הדגימה מספר פעמים.ממוצע הערך האפור הממוצע מחמישה עד שמונה אזורי רקע, ושחרר את הערכים העשרוניים. הפחת את הערכים מכל פיקסל בתמונה על-ידי בחירה בתפריט 'תהליך', ולאחר מכן לחץ על 'מתמטיקה' ו'הפחת'. לאחר מכן, הזינו את ערך הרקע להפחתה, ולחצו על הלחצן 'אשר'. במידת הצורך, מזגו את הערוצים בחזרה לתמונה רב-ערוצית על-ידי בחירה בתפריט 'תמונה', ואחר כך לחצו על 'צבע' ובחרו 'מזג ערוצים'.כדי לספור את מספר התאים הפלואורסצנטיים הירוקים, הסתירו את הערוץ הירוק וציירו צורה סביב אזור המוח המבטאת פלואורסצנטיות אדומה באמצעות כלי הבחירה החופשית. לחץ על הפונקציה Measure כדי למדוד את השטח, הצפיפות המשולבת והערך האפור הממוצע של הערוץ האדום באזור שנבחר. ספור את מספר התאים הירוקים באמצעות כלי בחירה מרובה נקודות, ונרמל את מספר התאים הירוקים לפי העוצמה המשולבת של הערוץ האדום.לאחר התמרה של כתב המשפר שהעכבר הזריק תוך גולגולתי ב-P0 עם מבנה AAV חיובי הראה ביטוי EGFP מונע משפר בשכבות התחתונות האמצעיות של קליפת המוח 28 ימים לאחר ההזרקה. העכבר שהוזרק לו מבנה בקרה שלילי ב-P0 אינו מראה כל ביטוי של EGFP 28 יום לאחר ההזרקה, מה שמדגים כי האלמנטים המשפרים נמצאים כמניעים שעתוק של EGFP במוח העכבר. כדי להמחיש את האזור המומר בהצלחה ואת השליטה על השתנות פוטנציאלית, נבדקו ספריות כתבים של משפרים שנמסרו על ידי AAV של טיטרים שונים.ספריית הטיטר הגבוהה של משפרי מועמדים מניעה ביטוי EGFP רחב ואילו ספריית הטיטר התחתונה של משפרי מועמדים מניעה ביטוי CGFP דליל במוח עכבר P7. חיוני לערבב את כתב המשפר AAV עם השליטה החיובית בכל זריקה על מנת להבחין בין משפרים ללא פעילות לבין משלוחים כושלים. ניתן לשלב הליך זה עם אימונוהיסטוכימיה, RNA FISH או ריצוף RNA חד-תאי כדי לקבוע באילו סוגי תאים המשפר פעיל.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

אין ויוו יישוב ביטוי של חלבונים Optogenetic באמצעות סרטי משי/AAV

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...