Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

Sekvensering ble utført ved UC Davis DNA Technologies Core. Vi takker laboratoriet til Lin Tian ved UC Davis for opplæring på rAAV-emballasje og sjenerøst gifting oss AAV-hjelper og rep / cap plasmider. Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIGMS R35GM119831.

Denne protokollen er godkjent av UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #22339) og UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Denne protokollen er testet på C57BL/6J mus av begge kjønn på postnatal dag 0-1.
1. Klon forsterkerkandidatsekvensen til AAV-vektorplasmidet.
MERK: De representative protokollene er gitt, men kloningsstrategien har en høy grad av fleksibilitet.
<ol><li>Velg eller utform en reporterk...

Denne protokollen beskriver en rAAV-basert metode for distribusjon av enhancer-drevne transgener i den postnatale musehjernen. I denne generaliserte protokollen blir en kandidatforsterker, en minimal promotor, et reportergen og en valgfri strekkodesekvens klonet til en AAV-plasmid-ryggrad. Disse eksperimentene kan gjøres med en enkelt kandidatforsterkersekvens eller med mange sekvenser parallelt. Plasmidet pakkes inn i en rAAV og leveres til den postnatale musehjernen. Etter en periode for å tillate virustransduksjon, ...

Enhancers er genomiske cis-regulatoriske elementer som fungerer som transkripsjonsfaktorbindingssteder og kan drive uttrykket av et målgen på en spatiotemporalt spesifikk måte 1,2. De er differensielt aktive i forskjellige celletyper, vev og utviklingsstadier og kan være substrater for sykdomsrisikorelatert genomisk variasjon 3,4. Dermed er behovet for å forstå dynamikken i enhancer-funksjonen avgjørende for fremgang i både translasjonelle og grunnleggende vitenskapelige applikasjoner innen genomikk. I silico spådommer om enhancer aktivitet kan tjene som gode ressurser for å generere hypoteser som til enhancer evne 5,6. Slik forutsagt forsterkeraktivitet kan kreve ytterligere validering og avhør for en full forståelse av den funksjonelle aktiviteten. Enhancer reporter analyser har vist seg verdifulle for dette formålet på tvers av en rekke systemer, fra celler til dyr 7,8,9. Mot å utvide disse studiene i en fleksibel og kostnadseffektiv forbigående in vivo-sammenheng, beskriver denne protokollen bruken av in vivo AAV-baserte metoder for å teste antatte forsterkersekvenser for deres evne til å drive uttrykket av et ektopisk reportergen i den postnatale musehjernen. Denne familien av metoder har nytte for å forhøre enkeltkandidatsekvenser eller parallellbiblioteksscreening og er relevant for grunnleggende og translasjonell forskning.
Denne metoden kombinerer i et enkelt plasmid en antatt forsterkerkandidat-DNA-sekvens med et reportergen (her EGFP), under kontroll av en minimal promotor som alene ikke driver signifikant uttrykk. Plasmidet pakkes i rekombinant AAV (rAAV) og injiseres i en dyremodell. Mens applikasjonen her er til hjernen, muliggjør ulike rAAV-serotyper infeksjon på tvers av forskjellige vevstyper, slik at denne tilnærmingen kan utvides til andre systemer10. Etter en periode kan hjernen samles og analyseres for ekspresjon av reportergenet. Sterkt uttrykk, sammenlignet med kontroller, indikerer at den testede kandidatsekvensen var i stand til å "forbedre" ekspresjonen av genet (figur 1). Denne enkle designen gir en enkel og klar tilnærming til å teste en sekvens for forsterkeraktivitet in vivo i hjernen.
I tillegg til testing for enhancer evne til en sekvens, kan denne metoden kombineres med teknikker for å bestemme celle-type enhancer aktivitet. I sekvensbaserte tilnærminger til å bestemme differensialforsterkeraktivitet kan sortering av celler på celletypespesifikke markører før DNA- og RNA-sekvensering tillate forskere å avgjøre om forskjellige celletyper viser differensialforsterkeraktivitet, som beskrevet i Gisselbrecht et al.11. I bildebaserte tilnærminger tillater sammerking av bilder med celletypespesifikke markører undersøkelse av om celler som viser enhancer-drevet fluorescens også viser celletypemarkører av interesse 12,13,14,15,16. Enhancer reporteranalyser muliggjør direkte testing av risikoassosiert allelisk variasjon i forsterkere for effekter på enhancer-evnen. De aller fleste risikosteder identifisert i genom-wide association studies (GWAS) ligger i ikke-kodende regioner av genomet17. Funksjonelle merknadsstudier av disse risikolokiene indikerer at en stor del sannsynligvis fungerer som forsterkere18,19,20. MPRA-distribusjon in vivo kan tillate testing av disse risikoassosierte variantene for forsterkeraktivitet i hjernen12,21. Endelig kan levering og henting på forskjellige tidspunkter gi innsikt i utviklingsstadiene der en forsterker er aktiv.
Enhancer-reporter plasmid design er mangfoldig og kan tilpasses for å passe eksperimentelle mål. Det finnes flere alternativer for minimal promotorer som har blitt brukt i enhancer forskning, for eksempel den menneskelige β-globin minimal promotor22 og musen Hsp68 minimal promotor23. Disse promotørene er kjent for å drive lave uttrykksnivåer med mindre de kombineres med et forsterkerelement for å aktivere dem. I motsetning til dette driver konstitutive promotorelementer sterkt uttrykk for det transgene, nyttig for positiv kontroll eller for å teste for forsterkerfunksjon mot en bakgrunn av robust uttrykk. Vanlige valg for konstitutive promotorer inkluderer CAG, en hybridpromotor avledet fra kylling β-aktinpromotoren og cytomegalovirus immediate-early enhancer24, eller human EF1α25. Siden forsterkere er kjent for å fungere toveis26, er orienteringen og plasseringen av forsterkeren i forhold til den minimale promotoren fleksibel (figur 2A). Tradisjonelle enhancer-reporter-analyser plasserer forsterkeren oppstrøms for promotoren og, i bibliotekleveranser, inkluderer en strekkodesekvens nedstrøms for reportergenet for å knytte sekvenseringsavlesninger med den testede forsterkeren27. Imidlertid kan forsterkere også plasseres i den åpne leserammen til reportergenet og tjene som sin egen strekkodesekvens, slik det gjøres i STARR-seq28. Protokollen beskrevet her benytter STARR-seq-analysedesignet, og plasserer kandidatforsterkersekvensen i 3 'UTR av reportergenet. Mens STARR-seq-orienteringen gir fordelen av mer strømlinjeformet kloning, er den mindre godt forstått enn den konvensjonelle tilnærmingen og kan indusere variabel RNA-stabilitet mellom konstruksjoner. De beskrevne metodene kan enkelt tilpasses enten STARR-seq eller konvensjonell orientering med mindre endringer i kloningsprosessen som er beskrevet andre steder27,29.
Ulike metoder for AAV-levering kan brukes til å tilpasse denne teknikken ytterligere for å passe eksperimentelle mål (figur 2B). Direkte intrakranielle injeksjoner, beskrevet nærmere i denne protokollen, gir en høy konsentrasjon av virus direkte til hjernen30. Dette gir en høy transduksjonseffektivitet sentrert på injeksjonsstedet, noe som gjør dette til en utmerket teknikk for eksperimenter som ønsker å maksimere tettheten av transducerte celler over et område av vev. Stereotaktisk injeksjon kan bidra til å standardisere injeksjonsstedet på tvers av dyr for reproduserbar lokalisert transduksjon. Intrakraniale injeksjoner er mest enkle hos tidlige postnatale dyr. Som en alternativ teknikk kan systemiske injeksjoner levere transgener ved hjelp av AAV med serotyper som er i stand til å krysse blod-hjernebarrieren31. Tail-vene injeksjoner tillate viruset å sirkulere gjennom hele kroppen, slik at generalisert levering over mange vev10. Retro-orbitale injeksjoner er en annen systemisk injeksjonsteknikk som leverer viruset bak øyet inn i retro-orbital sinus32. Dette gir en mer direkte rute for AAV fra venesystemet til hjernen, noe som resulterer i en høyere konsentrasjon av transducerte celler i hjernen enn injeksjoner i flere perifere blodkar33.
Et annet fleksibelt aspekt ved denne teknikken er metoden for avlesning. I grove trekk kan alternativene beskrives som reporterbaserte eller sekvenseringsbaserte (figur 2C). Inkorporering av en fluorescerende reporter som GFP i den åpne leserammen til konstruksjonen resulterer i uttrykket av det fluorescerende proteinet i noen transducerte celler der kandidatforsterkeren kjørte uttrykk. Merkings- og avbildningsteknikker som immunhistokjemi muliggjør signalforsterkning. Sekvenseringsbaserte avlesningsteknikker innebærer å identifisere sekvenser fra den leverte konstruksjonen i RNA samlet fra vevet. Ved å kvantifisere mengden viralt DNA som opprinnelig ble levert, kan sammenligningen av uttrykt RNA versus levert DNA brukes til å bestemme i hvilken grad en testet forsterkersekvens var i stand til å drive økt uttrykk for transgenet, for eksempel i sammenheng med en massivt parallell reporteranalyse (MPRA). MPRA-er tilbyr en kraftig utvidelse av disse teknikkene for å teste opptil tusenvis av kandidatforsterkere for aktivitet samtidig og har blitt beskrevet omfattende i genomforskning 12,27,34,35,36. Høyere gjennomstrømningsscreening oppnås ved å utføre kloning, pakking, levering og sekvenseringstrinn for kandidatforsterkere i batch i stedet for individuelt.
Valg av kandidatforbedring gir en annen mulighet for fleksibilitet (figur 2D). For eksempel kan denne analysen brukes til å identifisere forsterkere av et bestemt gen, for å fastslå funksjonen til ikke-kodende DNA-regioner av interesse, eller for å bestemme bestemte celletyper eller utviklingsstadier der en forsterker er aktiv - som alle tjener mål både i grunnvitenskap og i sykdomsforskning. Generelt er valg av kandidatforsterker drevet av in silico-spådommer om enhancer-aktivitet. Vanligvis inkluderer silico-prediksjoner ChIP-seq for histonmodifikasjoner som indikerer sannsynlige forsterkere, for eksempel H3K27ac 37 og kromatin tilgjengelighetskartlegging 38. Endelig er et voksende forskningsområde den funksjonsbaserte screeningen av syntetisk utformede forsterkerelementer, noe som muliggjør studier av hvordan forsterkersekvensen styrer funksjon39 og utformingen av forsterkere med spesifikke egenskaper40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Enhancers er bindende plattformer for et mangfoldig utvalg av transkripsjonsfaktorer som driver spesifikke uttrykksmønstre av vevs- og celletypespesifikke gener. Flere metoder for å vurdere ikke-kodende DNA og forskjellige kromatintilstander har vist seg å være nyttige for å forutsi tilstedeværelsen av forsterkersekvenser i genomet, men å validere aktiviteten til disse sekvensene og finne organene og utviklingsstadiene de er aktive i, er en arbeidsintensiv prosess. Nylige fremskritt i adeno-assosierte virus (AAV) vektorer har muliggjort utbredt levering av transgener til musevev, noe som muliggjør in vivo enhancer testing uten å nødvendiggjøre et transgent dyr. Denne protokollen viser hvordan en reporterkonstruksjon som uttrykker EGFP under kontroll av en minimal promotor, som ikke driver signifikant uttrykk alene, kan brukes til å studere aktivitetsmønstrene til kandidatforsterkersekvenser i musehjernen. En AAV-pakket reporterkonstruksjon leveres til musehjernen og inkuberes i 1-4 uker, hvoretter dyret ofres, og hjerneseksjoner observeres under et mikroskop. EGFP vises i celler der den testede forsterkeren er tilstrekkelig til å initiere genuttrykk, og identifiserer plasseringen og utviklingsstadiet der forsterkeren er aktiv i hjernen. Standard kloningsmetoder, rimelig AAV-emballasje og utvidelse av AAV-serotyper og metoder for in vivo-levering og standard bildeavlesning gjør dette til en tilgjengelig tilnærming for studiet av hvordan genuttrykk reguleres i hjernen.

Ved hjelp av disse metodene ble en 915 bp-sekvens i den psykiatriske risikoassosierte tredje intronen av genet CACNA1C19,49,50 testet for forsterkeraktivitet i den postnatale musehjernen. Denne sekvensen ble oppdaget i en MPRA på 345 kandidatforsterkersekvenser sentrert på psykiatrisk og nevrologisk risiko SNPs12, og karakteriseringseksperimenter er beskrevet her som et generelt eksempel. C57BL...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Denne protokollen beskriver en ny rAAV-basert forbigående enhancer-reporter-analyse. Denne analysen kan brukes til å indusere enhancer-drevet uttrykk in vivo i musehjernen.

AAV-distribusjon av Enhancer-baserte uttrykkskonstruksjoner in vivo i musehjerne

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Denne protokollen er viktig fordi den muliggjør visualisering av ikke bare om en forsterkersekvens kan drive uttrykk, men hvor den kan drive uttrykk i en bestemt del av kroppen. Det er raskt. Injeksjonene tar mindre enn 10 minutter å fullføre, og om og hvor et reportergen uttrykkes, kan ses i løpet av få dager etter prøveinnsamling.For å starte kloningen, velg eller design en reporterkonstruksjon. Konstruksjonen som brukes her plasserer forsterkerkandidaten i de tre primære uoversatte regionene i et EGFP-reportergen uttrykt under kontroll av hsp68 minimal promotor. For å designe PCR-primerne for å forsterke en sekvens av interesse og kloning i vektoren, legg til riktig homologiarm for Gibson-kloning til den fem primære enden av primerne.Bruk de designede primerne, utfør PCR fra en DNA-prøve. Fordøye ett til 10 mikrogram vektor-DNA ved hjelp av Pac1 og Asc1, avhengig av ønsket antall kloningsreaksjoner som kreves. Ved å bruke 0,7 til 1% gelelektroforese i 30 til 60 minutter ved 100 volt, separer restriksjonsfordøyelsesfragmentene.Pakk ut båndet for den lineariserte vektoren, og rens den med et kommersielt gelekstraksjonssett. Når Gibson-kloning og transformasjon av celler er fullført, plate cellene på selektive medier, og inkuberer over natten ved 37 grader Celsius. Etter å ha verifisert den vellykkede kloningen av reporterkonstruksjonen, inokulerer du fem milliliter av startkulturen ved hjelp av glyserollageret.Dyrk kulturen i åtte til 16 timer i en ristende inkubator ved 30 grader Celsius og 180 rotasjoner per minutt. Når buljongen blir overskyet, fortynn startkulturen 1.000x i 250 til 300 ml fersk selektiv LB-buljong, og inkuberer den over natten i en ristende inkubator ved 30 grader Celsius og 180 rotasjoner per minutt. Bruk et kommersielt plasmid maxi-sett, rens plasmidet.For å teste for rekombinasjon av ITR, utfør en Xma1-fordøyelse. Visualiser bandene. Sørg for at sammendraget ditt viser forventet antall bånd.Rekombinasjon vil resultere i færre bånd enn forventet. Forbered rekombinant AAV-blanding for levering. Hvis du sammenligner uttrykksmønstrene til flere enhancer-reportervirus, fortynner du hvert virus for å likestille virustiterne med det minst konsentrerte viruset.Bland enhancer reporter virus og konstitutivt uttrykt kontroll reporter virus i et forhold på to til en eller tre til en. Tilsett en liten mengde raskt grønt fargestoff med en endelig konsentrasjon på 0,06%Bryt spissen av en trukket glasspipette laget av et mikroliter-gradert kapillærrør ved å stikke det forsiktig inn i en delikat, lofri klut. Sett pipetten inn i en aspiratorenhet med en trykkpåførende enhet koblet til en gummipakning for å holde en mikrokapillær pipette.Trekk et lite volum på rundt 0,2 til 0,5 mikroliter mineralolje inn i pipetten ved å påføre undertrykk gjennom aspiratoren. Hold aspiratorenheten til side, og legg viruset på is til det er klart til å injiseres. Etter kryobedøvelse av de nyfødte musene, påfør negativt trykk ved hjelp av aspiratorenheten, og trekk virusblandingen inn i den trukket glasspipetten til menisken passerer to-mikroliter-kryssmerket.Ta musen bort fra det kalde kammeret, og legg den på benken. Lokaliser de bilaterale injeksjonsstedene midtveis mellom lambda og bregma, sagittal sutur og hvert øye. Desinfiser dem med en alkoholserviett.Pierce skallen til de nyfødte musene ved hjelp av den trukket glasspipetten. Når nålen kommer inn i skallen, påfør et positivt trykk gjennom aspiratorenheten. Dispenser en mikroliter av viruset i lateral ventrikel, og trekk pipetten.Plasser musen på en varmepute eller et varmekammer for å komme seg. Returner dyret til hjemmeburet når det er vekket. Ta fluorescensbilder som transverserer hjerneseksjonen ved hjelp av en lav forstørrelse 5x subjektiv linse.Ved å lokalisere injeksjonsstedet, vurder omfanget av virustransduksjon, avhengig av tettheten og intensiteten av røde fluorescerende celler. Sammenlign dyrene som ble transdusert på samme måte. Ta fluorescerende bilder med et objektiv med høyere forstørrelse på mer enn 25x.Deretter åpner du analyseprogramvaren, og bruker et tre-til-tre medianfilter for å redusere støy. Klikk på Prosess-menyen, klikk deretter på Støy, og velg Despeckle-alternativet. Deretter, for å trekke bakgrunnsfluorescensen fra bildene, start med å skille kanalene til et flerkanalsbilde.Klikk på Bilde-menyen, klikk deretter på Farge, og velg alternativet Del kanaler. Bruk rektangel- eller sirkelmarkeringsverktøyet til å tegne en liten form i et område av bildet uten fluorescerende celler. Mål den gjennomsnittlige pikselintensiteten i bakgrunnen ved å klikke på Analyser og deretter Mål, og gjenta for å prøve flere ganger.Gjennomsnitt av den gjennomsnittlige grå verdien fra fem til åtte bakgrunnsområder, og slipp desimalverdiene. Trekk verdiene fra hvert bildepunkt i bildet ved å velge Prosess-menyen, og klikk deretter Matematikk og Trekk fra. Deretter skriver du inn bakgrunnsverdien du vil trekke fra, og klikker OK. Slå om nødvendig kanalene tilbake til et flerkanalsbilde ved å velge Bilde-menyen, klikk deretter på Farge og velg Slå sammen kanaler.For å telle antall grønne fluorescerende celler, skjul den grønne kanalen og tegn en form rundt hjerneområdet som uttrykker rød fluorescens ved hjelp av friformvalgverktøyet. Klikk på målefunksjonen for å måle området, integrert tetthet og gjennomsnittlig gråverdi for den røde kanalen i den valgte sonen. Tell antall grønne celler ved hjelp av et flerpunktsmarkeringsverktøy, og normaliser antall grønne celler med den integrerte intensiteten til den røde kanalen.Etter å ha transdusert forsterkerreporteren at musen injiserte intrakranielt ved P0 med en positiv AAV-konstruksjon, viste forbedringsdrevet EGFP-uttrykk i de midterste nedre lagene av cortex 28 dager etter injeksjon. Musen injisert med en negativ kontrollkonstruksjon ved P0 viser ikke noe uttrykk for EGFP 28 dager etter injeksjon, noe som viser at forsterkerelementene er funnet å drive transkripsjon av EGFP i musehjernen. For å visualisere det vellykkede transducerte området og kontrollere for potensiell variabilitet, ble AAV-leverte enhancer-reporterbiblioteker av forskjellige titere undersøkt.Det høye titerbiblioteket med kandidatforsterkere driver bredt EGFP-uttrykk, mens det nedre titerbiblioteket med kandidatforsterkere driver sparsomt CGFP-uttrykk i P7-musehjernen. Det er viktig å blande forsterkerreporteren AAV med den positive kontrollen ved hver injeksjon for å skille mellom forsterkere uten aktivitet og mislykkede leveranser. Denne prosedyren kan parres med immunhistokjemi, RNA FISH eller encellet RNA-sekvensering for å bestemme hvilke celletyper en forsterker er aktiv i.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinvlerina: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-mediert transgene uttrykk for chimeriske konstruksjoner for å studere Behavioral Funksjon GPCR Heteromers i Mus

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

I Vivo Målrettet uttrykk for Optogenetic proteiner med silke/AAV filmer

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillary To-foton In vivo Avbildning av musens netthinne

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

En rottemodell av EcoHIV hjerneinfeksjon

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...