Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

O sequenciamento foi realizado no UC Davis DNA Technologies Core. Agradecemos ao laboratório de Lin Tian na UC Davis por treinar em embalagens rAAV e generosamente nos presentear com ajudante AAV e plasmídeos rep/cap. Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NIGMS R35GM119831.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UC Davis (Protocolo #22339) e pelo Comitê de Biossegurança Institucional da UC Davis (BUA-R1903). Este protocolo foi testado em camundongos C57BL/6J de ambos os sexos no dia pós-natal 0-1.
1. Clone a sequência candidata potenciadora no plasmídeo vetorial AAV.
Observação : os protocolos representativos são fornecidos, mas a estratégia de clonagem tem um alto...

Este protocolo descreve um método baseado em rAAV para a implantação de transgenes impulsionados por potenciadores no cérebro de camundongos pós-natais. Neste protocolo generalizado, um potenciador candidato, um promotor mínimo, um gene repórter e uma sequência de código de barras opcional são clonados em uma espinha dorsal do plasmídeo AAV. Esses experimentos podem ser feitos com uma única sequência de potenciador de candidatos ou com muitas sequências em paralelo. O plasmídeo é embalado em um rAAV e ent...

Os potenciadores são elementos cis-reguladores genômicos que servem como sítios de ligação do fator de transcrição e podem conduzir a expressão de um gene alvo de maneira espaço-temporalmente específica 1,2. Eles são diferencialmente ativos em diferentes tipos celulares, tecidos e estágios de desenvolvimento e podem ser substratos da variação genômica relacionada ao risco de doença 3,4. Assim, a necessidade de entender a dinâmica da função do potenciador é fundamental para o progresso em aplicações translacionais e científicas básicas dentro da genômica. Previsões in silico de atividade potenciadora podem servir como excelentes recursos para gerar hipóteses quanto à capacidade potencializadora 5,6. Tal atividade potenciadora prevista pode exigir validação e interrogação adicionais para uma compreensão completa da atividade funcional. Os ensaios do Enhancer Reporter têm se mostrado valiosos para esse fim em uma variedade de sistemas, de células a animais 7,8,9. No sentido de estender esses estudos em um contexto transiente in vivo flexível e econômico, este protocolo descreve o uso de métodos baseados em AAV in vivo para testar supostas sequências potenciadoras de sua capacidade de conduzir a expressão de um gene repórter ectópico no cérebro de camundongo pós-natal. Essa família de métodos tem utilidade para interrogar sequências candidatas únicas ou triagem paralela de bibliotecas e é relevante para pesquisas básicas e translacionais.
Este método combina em um único plasmídeo uma suposta sequência de DNA candidato a potenciador com um gene repórter (aqui EGFP), sob o controle de um promotor mínimo que por si só não conduz a expressão significativa. O plasmídeo é embalado em AAV recombinante (rAAV) e injetado em um modelo animal. Embora a aplicação aqui seja para o cérebro, vários sorotipos de rAAV permitem a infecção em diferentes tipos de tecidos, de modo que essa abordagem pode ser estendida a outros sistemas10. Após um período de tempo, o cérebro pode ser coletado e ensaiado para a expressão do gene repórter. A expressão forte, comparada aos controles, indica que a sequência candidata testada foi capaz de "aprimorar" a expressão do gene (Figura 1). Este design simples oferece uma abordagem fácil e clara para testar uma sequência de atividade potenciadora in vivo no cérebro.
Além de testar a capacidade de potenciador de uma sequência, este método pode ser combinado com técnicas para determinar a atividade do potenciador do tipo celular. Em abordagens baseadas em sequências para determinar a atividade diferencial do potenciador, a classificação de células em marcadores específicos do tipo celular antes do sequenciamento de DNA e RNA pode permitir que os pesquisadores determinem se diferentes tipos de células apresentam atividade diferencial do potenciador, como foi descrito em Gisselbrecht et al.11. Em abordagens baseadas em imagens, a co-marcação de imagens com marcadores específicos do tipo celular permite examinar se as células que exibem fluorescência impulsionada por potenciador também exibem marcadores do tipo celular de interesse 12,13,14,15,16. Os ensaios do repórter Enhancer permitem o teste direto da variação alélica associada ao risco em potenciadores para efeitos sobre a capacidade do potenciador. A grande maioria dos loci de risco identificados em estudos de associação genômica ampla (GWAS) encontra-se em regiões não codificantes do genoma17. Estudos de anotação funcional desses loci de risco indicam que uma grande parcela provavelmente atua como potenciadores18,19,20. A implantação in vivo do MPRA pode permitir o teste dessas variantes associadas ao risco para a atividade potencializadora no cérebro12,21. Finalmente, a entrega e a coleta em diferentes pontos de tempo podem oferecer insights sobre os estágios de desenvolvimento durante os quais um intensificador está ativo.
Os projetos de plasmídeos do Enhancer-reporter são diversos e podem ser personalizados para atender aos objetivos experimentais. Existem várias opções para promotores mínimos que têm sido utilizados na pesquisa de potenciadores, como o promotor mínimo de β-globina humana22 e o promotor mínimo Hsp68 do rato23. Esses promotores são conhecidos por conduzir baixos níveis de expressão, a menos que combinados com um elemento potenciador para ativá-los. Em contraste, os elementos promotores constitutivos impulsionam uma forte expressão do transgene, útil para o controle positivo ou para testar a função potenciadora em um contexto de expressão robusta. As escolhas comuns para promotores constitutivos incluem CAG, um promotor híbrido derivado do promotor de β-actina de frango e do potenciador imediato-precoce do citomegalovírus24, ou EF1α25 humano. Como os intensificadores são conhecidos por trabalhar bidirecionalmente26, a orientação e a localização do intensificador em relação ao promotor mínimo são flexíveis (Figura 2A). Os ensaios tradicionais de intensificador-repórter colocam o intensificador a montante do promotor e, nas entregas da biblioteca, incluem uma sequência de código de barras a jusante do gene do repórter para associar as leituras de sequenciamento ao intensificador testado27. No entanto, os intensificadores também podem ser colocados no quadro de leitura aberto do gene repórter e servir como sua própria sequência de código de barras, como é feito no STARR-seq28. O protocolo descrito aqui utiliza o desenho do ensaio STARR-seq, colocando a sequência de potenciadores candidatos na UTR de 3' do gene repórter. Embora a orientação STARR-seq ofereça o benefício de uma clonagem mais simplificada, ela é menos bem compreendida do que a abordagem convencional e pode induzir a estabilidade variável do RNA entre construtos. Os métodos descritos podem ser facilmente adaptados à orientação STARR-seq ou convencional com pequenas alterações no processo de clonagem descritas em outros lugares27,29.
Diferentes métodos de entrega de AAV podem ser empregados para personalizar ainda mais essa técnica para se adequar aos objetivos experimentais (Figura 2B). As injeções intracranianas diretas, descritas mais adiante neste protocolo, fornecem uma alta concentração de vírus diretamente ao cérebro30. Isso proporciona uma alta eficiência de transdução centrada no local da injeção, tornando esta uma excelente técnica para experimentos que procuram maximizar a densidade das células transduzidas sobre uma área de tecido. A injeção estereotáxica pode ajudar a padronizar o local de injeção em animais para transdução localizada reprodutível. As injeções intracranianas são mais simples em animais pós-natais precoces. Como técnica alternativa, as injeções sistêmicas podem fornecer transgenes usando AAVs com sorotipos capazes de atravessar a barreira hematoencefálica31. As injeções na veia caudal permitem que o vírus circule por todo o corpo, permitindo a entrega generalizada em muitos tecidos10. As injeções retroorbitais são outra técnica de injeção sistêmica que entrega o vírus atrás do olho no seio retroorbital32. Isso oferece uma rota mais direta para o AAV do sistema venoso para o cérebro, resultando em uma maior concentração de células transduzidas no cérebro do que injeções em vasos sanguíneos mais periféricos33.
Outro aspecto flexível dessa técnica é o método de leitura. Em termos gerais, as opções podem ser descritas como baseadas em repórter ou em sequenciamento (Figura 2C). A incorporação de um repórter fluorescente, como a GFP, no quadro de leitura aberto do construto resulta na expressão da proteína fluorescente em quaisquer células transduzidas em que o potenciador candidato impulsionou a expressão. Técnicas de marcação e imagem, como a imuno-histoquímica, permitem a amplificação do sinal. As técnicas de leitura baseadas em sequenciamento envolvem a identificação de sequências do construto entregue no RNA coletado do tecido. Ao quantificar a quantidade de DNA viral que foi inicialmente entregue, a comparação de RNA expresso versus DNA entregue pode ser usada para determinar o grau em que uma sequência de potenciador testada foi capaz de impulsionar o aumento da expressão do transgene, por exemplo, no contexto de um ensaio de repórter massivamente paralelo (MPRA). Os MPRAs oferecem uma poderosa expansão dessas técnicas para testar até milhares de potenciadores candidatos para atividade simultaneamente e têm sido amplamente descritos em pesquisas genômicas 12,27,34,35,36. A triagem de taxa de transferência mais alta é alcançada executando etapas de clonagem, empacotamento, entrega e sequenciamento para potenciadores candidatos em lote, em vez de individualmente.
A seleção do potencializador de candidatos oferece outra oportunidade de flexibilidade (Figura 2D). Por exemplo, este ensaio pode ser usado para identificar potenciadores de um gene específico, para determinar a função de regiões de DNA não codificantes de interesse, ou para determinar tipos específicos de células ou estágios de desenvolvimento durante os quais um potenciador está ativo - todos os quais servem a objetivos tanto na ciência básica quanto na pesquisa de doenças. Geralmente, a seleção do potenciador de candidatos é impulsionada por previsões in silico da atividade do potenciador. Comumente, as previsões in silico incluem ChIP-seq para modificações de histonas que indicam prováveis potenciadores, como H3K27ac37 e mapeamento de acessibilidade à cromatina38. Finalmente, uma área crescente de pesquisa é a triagem baseada em função de elementos potenciadores sinteticamente projetados, permitindo estudos de como a sequência do intensificador direciona a função39 e o projeto de intensificadores com propriedades específicas40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Os potenciadores são plataformas de ligação para uma gama diversificada de fatores de transcrição que impulsionam padrões de expressão específicos de genes específicos de tecidos e células. Múltiplos meios de avaliar o DNA não codificante e vários estados de cromatina provaram ser úteis para prever a presença de sequências potencializadoras no genoma, mas validar a atividade dessas sequências e encontrar os órgãos e estágios de desenvolvimento em que estão ativas é um processo trabalhoso. Avanços recentes em vetores de vírus adenoassociados (AAV) permitiram a entrega generalizada de transgenes aos tecidos de camundongos, permitindo testes de potenciadores in vivo sem a necessidade de um animal transgênico. Este protocolo mostra como um construto de repórter que expressa EGFP sob o controle de um promotor mínimo, que não conduz a expressão significativa por si só, pode ser usado para estudar os padrões de atividade de sequências de potenciadores candidatos no cérebro do rato. Uma construção de repórter embalada em AAV é entregue ao cérebro do rato e incubada por 1-4 semanas, após o que o animal é sacrificado e seções cerebrais são observadas sob um microscópio. O EGFP aparece em células nas quais o potenciador testado é suficiente para iniciar a expressão gênica, identificando a localização e o estágio de desenvolvimento em que o potenciador está ativo no cérebro. Métodos de clonagem padrão, embalagem de AAV de baixo custo e sorotipos e métodos de AAV em expansão para entrega in vivo e leitura de imagem padrão tornam esta uma abordagem acessível para o estudo de como a expressão gênica é regulada no cérebro.

Usando esses métodos, uma sequência de 915 pb no terceiro íntron associado ao risco psiquiátrico do gene CACNA1C19,49,50 foi testada quanto à atividade potencializadora no cérebro de camundongos pós-natais. Esta sequência foi descoberta em um MPRA de 345 sequências de potenciadores candidatos centrados em SNPs de risco psiquiátrico e neurológico12 e os experimentos de caracterização ...

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AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Este protocolo descreve um novo ensaio de intensificador-repórter transitório baseado em rAAV. Este ensaio pode ser usado para induzir a expressão impulsionada por potenciadores in vivo no cérebro do rato.

Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador in vivo no cérebro do rato

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Esse protocolo é significativo porque permite a visualização não apenas se uma sequência de intensificador pode conduzir a expressão, mas também se pode conduzir a expressão em uma parte específica do corpo. É rápido. As injeções levam menos de 10 minutos para serem concluídas, e se e onde um gene repórter é expresso pode ser visto dentro de apenas alguns dias após a coleta da amostra.Para iniciar a clonagem, escolha ou crie uma construção de repórter. O construto aqui utilizado coloca o candidato potenciador nas três principais regiões não traduzidas de um gene repórter do EGFP expresso sob o controle do promotor mínimo hsp68. Para projetar os primers de PCR para amplificar uma sequência de interesse e clonagem no vetor, adicione o braço de homologia apropriado para clonagem de Gibson à extremidade principal dos primers.Usando os primers projetados, execute a PCR a partir de uma amostra de DNA. Digerir de um a 10 microgramas de DNA vetorial usando Pac1 e Asc1, dependendo do número desejado de reações de clonagem necessárias. Ao empregar eletroforese de 0,7 a 1% em gel por 30 a 60 minutos a 100 volts, separe os fragmentos de digestão de restrição.Extraia a banda para o vetor linearizado e purifique-a com um kit comercial de extração em gel. Uma vez concluída a clonagem e transformação de células de Gibson, coloque as células em meio seletivo e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Após verificar a clonagem bem-sucedida do construto repórter, inocular cinco mililitros da cultura inicial usando o estoque de glicerol.Cultive a cultura por oito a 16 horas em uma incubadora de agitação a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto. À medida que o caldo ficar turvo, dilua a cultura inicial de 1.000x em 250 a 300 mililitros de caldo LB seletivo fresco e incube-o durante a noite em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto. Usando um kit maxi de plasmídeo comercial, purifique o plasmídeo.Para testar a recombinação dos ITRs, execute uma digestão Xma1. Visualize as bandas. Certifique-se de que seu resumo mostre o número esperado de bandas.A recombinação resultará em bandas menores do que o esperado. Prepare a mistura de AAV recombinante para entrega. Ao comparar os padrões de expressão de vários vírus repórteres intensificadores, dilua cada vírus para equiparar os títulos do vírus ao vírus menos concentrado.Misture o vírus do repórter potenciador e o vírus do repórter de controle expresso constitutivamente em uma proporção de dois para um ou três para um. Adicione uma pequena quantidade de corante verde rápido com uma concentração final de 0,06%Quebre a ponta de uma pipeta de vidro puxada feita de um tubo capilar graduado em microlitros, perfurando-a suavemente em um lenço delicado e sem fiapos. Insira a pipeta em um conjunto de aspirador com um dispositivo de aplicação de pressão conectado a uma junta de borracha para segurar uma pipeta microcapilar.Desenhe um pequeno volume de cerca de 0,2 a 0,5 microlitros de óleo mineral na pipeta aplicando pressão negativa através do aspirador. Mantenha o conjunto do aspirador de lado e coloque o vírus no gelo até que esteja pronto para injetar. Depois de anestesiar crioanestesiar os camundongos neonatais, aplique pressão negativa usando o conjunto do aspirador e puxe a mistura de vírus para a pipeta de vidro puxada até que o menisco passe a marca de escala de dois microlitros.Tire o mouse da câmara fria e coloque-o na bancada. Localize os locais de injeção bilateral a meio caminho entre o lambda e o bregma, bem como a sutura sagital e cada olho. Higienize-os usando um toalhete com álcool.Perfure o crânio dos ratos neonatais usando a pipeta de vidro puxada. À medida que a agulha entra no crânio, aplique uma pressão positiva através do conjunto do aspirador. Dispense um microlitro do vírus no ventrículo lateral e retire a pipeta.Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ou uma câmara de aquecimento para recuperar. Devolva o animal para a gaiola de casa uma vez acordado. Grave imagens de fluorescência que atravessam a seção do cérebro usando uma lente subjetiva de baixa ampliação 5x.Ao localizar o local da injeção, avalie a extensão da transdução do vírus, dependendo da densidade e intensidade das células fluorescentes vermelhas. Compare os animais que foram transduzidos de forma semelhante. Grave imagens fluorescentes com uma lente objetiva de ampliação mais alta de mais de 25x.Em seguida, abra o software de análise e aplique um filtro mediano de três por três para reduzir o ruído. Clique no menu Processo, clique em Ruído e escolha a opção Despeckle. Em seguida, para subtrair a fluorescência de fundo das imagens, comece separando os canais de uma imagem multicanal.Clique no menu Imagem, clique em Cor e selecione a opção Dividir canais. Usando a ferramenta de seleção de retângulo ou círculo, desenhe uma pequena forma em uma área da imagem sem células fluorescentes. Meça a intensidade média de pixels do plano de fundo clicando em Analisar e, em seguida, em Medir e repita para a amostra várias vezes.Faça a média do valor cinza médio de cinco a oito áreas de plano de fundo e solte os valores decimais. Subtraia os valores de cada pixel na imagem selecionando o menu Processo e clique em Matemática e Subtrair. Em seguida, insira o valor em segundo plano a ser subtraído e clique em OK. Se necessário, mescle os canais novamente em uma imagem multicanal selecionando o menu Imagem, clique em Cor e selecione Mesclar canais.Para contar o número de células fluorescentes verdes, oculte o canal verde e desenhe uma forma ao redor da região do cérebro expressando fluorescência vermelha usando a ferramenta de seleção de forma livre. Clique na função Medir para medir a área, a densidade integrada e o valor cinza médio do canal vermelho na zona selecionada. Conte o número de células verdes usando uma ferramenta de seleção de vários pontos e normalize o número de células verdes pela intensidade integrada do canal vermelho.Depois de transduzir o intensificador repórter que o rato injetado intracranialmente em P0 com um construto AAV positivo mostrou expressão EGFP impulsionada pelo potenciador nas camadas médias inferiores do córtex 28 dias após a injeção. O rato injetado com uma construção de controlo negativo em P0 não mostra qualquer expressão de EGFP 28 dias após a injeção, demonstrando que os elementos potenciadores são encontrados para conduzir a transcrição de EGFP no cérebro do rato. Para visualizar a área transduzida com sucesso e controlar a variabilidade potencial, foram examinadas bibliotecas de repórteres intensificadores entregues por AAV de diferentes títulos.A biblioteca de títulos altos de potenciadores candidatos impulsiona a expressão ampla do EGFP, enquanto a biblioteca de títulos inferiores dos potenciadores candidatos impulsiona a expressão CGFP esparsa no cérebro do rato P7. É vital misturar o AAV do repórter potenciador com o controle positivo em cada injeção, a fim de distinguir entre potenciadores sem atividade e partos falhados. Este procedimento pode ser emparelhado com imuno-histoquímica, RNA FISH ou sequenciamento de RNA de célula única para determinar em quais tipos de células um potenciador está ativo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

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Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

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Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificação de embarcações do cérebro do rato

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HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

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The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

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A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

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