Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

Секвенирование проводилось в UC Davis DNA Technologies Core. Мы благодарим лабораторию Лин Тяня в Калифорнийском университете в Дэвисе за обучение упаковке rAAV и щедро дарим нам помощника AAV и плазмиды rep /cap. Эта работа была поддержана NIH/NIGMS R35GM119831.

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Дэвисе (Протокол No 22339) и Институциональным комитетом по биобезопасности Калифорнийского университета в Дэвисе (BUA-R1903). Этот протокол был протестирован на мышах C57BL/6...

Этот протокол описывает основанный на rAAV метод развертывания трансгенов, управляемых энхансерами, в постнатальном мозге мыши. В этом обобщенном протоколе энхансер-кандидат, минимальный промотор, репортерный ген и необязательная последовательность штрих-кода клонируются в плазмидну?...

Энхансеры представляют собой геномные цис-регуляторные элементы, которые служат сайтами связывания транскрипционного фактора и могут стимулировать экспрессию гена-мишени пространственно-временнымспецифическим способом 1,2. Они дифференциально активны в различных типах клеток, тканях и стадиях развития и могут быть субстратами геномной вариации, связанной с риском заболевания 3,4. Таким образом, необходимость понимания динамики функции энхансера имеет решающее значение для прогресса как в трансляционных, так и в фундаментальных научных приложениях в геномике. In silico предсказания активности энхансера могут служить отличными ресурсами для генерации гипотез относительно способности усилителя 5,6. Такая предсказанная активность усилителя может потребовать дополнительной проверки и опроса для полного понимания функциональной активности. Анализы репортера Enhancer оказались ценными для этой цели в различных системах, от клеток до животных 7,8,9. Для расширения этих исследований в гибком и экономически эффективном переходном контексте in vivo этот протокол описывает использование методов на основе in vivo AAV для проверки предполагаемых последовательностей энхансеров на их способность управлять экспрессией эктопического репортерного гена в постнатальном мозге мыши. Это семейство методов полезно для опроса последовательностей с одним кандидатом или параллельного библиотечного скрининга и актуально для фундаментальных и трансляционных исследований.
Этот метод объединяет в одной плазмиде предполагаемую последовательность ДНК-кандидата энхансера с репортерным геном (здесь EGFP), под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значимой экспрессией. Плазмида упаковывается в рекомбинантный AAV (rAAV) и вводится в животную модель. В то время как применение здесь относится к мозгу, различные серотипы rAAV позволяют инфекцию через различные типы тканей, так что этот подход может быть распространен на другие системы10. Через некоторое время мозг может быть собран и проанализирован для экспрессии репортерного гена. Сильная экспрессия, по сравнению с контрольной группой, указывает на то, что тестируемая последовательность-кандидат смогла «усилить» экспрессию гена (рисунок 1). Эта простая конструкция предлагает легкий и понятный подход к тестированию последовательности активности энхансеров in vivo в мозге.
В дополнение к тестированию на энхансерную способность последовательности, этот метод может быть объединен с методами определения активности энхансера клеточного типа. В последовательных подходах к определению дифференциальной активности энхансеров сортировка клеток по маркерам клеточного типа до секвенирования ДНК и РНК может позволить исследователям определить, проявляют ли различные типы клеток дифференциальную активность энхансеров, как было описано в Gisselbrecht et al.11. В подходах, основанных на визуализации, совместная маркировка изображений с маркерами, специфичными для клеточного типа, позволяет изучить, отображают ли клетки, проявляющие флуоресценцию, управляемую энхансером, также маркеры клеточного типа, представляющие интерес 12,13,14,15,16. Репортерные анализы энхансеров позволяют напрямую тестировать связанные с риском аллельные вариации в энхансерах на предмет воздействия на способность усилителя. Подавляющее большинство локусов риска, идентифицированных в общегеномных ассоциативных исследованиях (GWAS), лежат в некодирующих областях генома17. Исследования функциональных аннотаций этих локусов риска показывают, что большая часть, вероятно, действует как энхансеры 18,19,20. Развертывание MPRA in vivo может позволить протестировать эти связанные с риском варианты активности энхансеров в мозге 12,21. Наконец, доставка и сбор в разные моменты времени могут дать представление о стадиях развития, на которых активен энхансер.
Конструкции плазмид Энхансер-Репортер разнообразны и могут быть настроены в соответствии с экспериментальными целями. Существует несколько вариантов минимальных промоторов, которые использовались в исследованиях энхансеров, таких как минимальный промотор22 β-глобина человека и минимальный промотор23 мышиного Hsp68. Известно, что эти промоторы приводят к низким уровням экспрессии, если не сочетаются с энхансерным элементом для их активации. Напротив, конститутивные промоторные элементы стимулируют сильную экспрессию трансгена, что полезно для положительного контроля или для тестирования на функцию энхансера на фоне надежной экспрессии. Общий выбор конститутивных промоторов включает CAG, гибридный промотор, полученный из промотора куриного β-актина и цитомегаловируса немедленно-раннего энхансера24 или человеческого EF1α25. Поскольку известно, что энхансеры работают двунаправленно26, ориентация и расположение энхансера относительно минимального промотора являются гибкими (рисунок 2А). Традиционные энхансерно-репортерные анализы помещают энхансер выше по течению промотора и, в библиотечных поставках, включают последовательность штрих-кода ниже по течению от гена репортера, чтобы связать показания секвенирования с тестируемым энхансером27. Тем не менее, энхансеры также могут быть помещены в открытую рамку чтения репортерного гена и служить их собственной последовательностью штрих-кода, как это сделано в STARR-seq28. Протокол, описанный здесь, использует конструкцию анализа STARR-seq, помещая последовательность энхансера-кандидата в 3'UTR репортерного гена. Хотя ориентация STARR-seq предлагает преимущество более упорядоченного клонирования, она менее понятна, чем традиционный подход, и может вызывать переменную стабильность РНК между конструкциями. Описанные способы могут быть легко адаптированы либо к STARR-seq, либо к обычной ориентации с незначительными изменениями в процессе клонирования, которые были описаны в другом месте27,29.
Различные методы доставки AAV могут быть использованы для дальнейшей настройки этого метода в соответствии с экспериментальными целями (рисунок 2B). Прямые внутричерепные инъекции, описанные далее в этом протоколе, доставляют высокую концентрацию вируса непосредственно в мозг30. Это дает высокую эффективность трансдукции, сосредоточенной в месте инъекции, что делает ее отличной техникой для экспериментов, направленных на максимизацию плотности трансдуцированных клеток на участке ткани. Стереотаксическая инъекция может помочь стандартизировать место инъекции у животных для воспроизводимой локализованной трансдукции. Внутричерепные инъекции наиболее просты у ранних послеродовых животных. В качестве альтернативного метода системные инъекции могут доставлять трансгены с использованием AAV с серотипами, способными пересекать гематоэнцефалический барьер31. Инъекции в хвостовые вены позволяют вирусу циркулировать по всему телу, обеспечивая генерализованную доставку через многие ткани10. Ретроорбитальные инъекции являются еще одним методом системной инъекции, который доставляет вирус за глаз в ретро-орбитальный синус32. Это обеспечивает более прямой путь для AAV из венозной системы в мозг, что приводит к более высокой концентрации трансдуцированных клеток в мозге, чем инъекции в более периферические кровеносные сосуды33.
Другим гибким аспектом этой техники является метод считывания. В широком смысле варианты можно описать как основанные на репортерах или последовательности (рисунок 2C). Включение флуоресцентного репортера, такого как GFP, в открытую рамку считывания конструкции приводит к экспрессии флуоресцентного белка в любых трансдуцированных клетках, где энхансер-кандидат управлял экспрессией. Методы маркировки и визуализации, такие как иммуногистохимия, позволяют усиливать сигнал. Методы считывания на основе секвенирования включают идентификацию последовательностей из доставленной конструкции в РНК, собранной из ткани. Количественно оценивая количество вирусной ДНК, которая была первоначально доставлена, сравнение экспрессированной РНК и доставленной ДНК может быть использовано для определения степени, в которой протестированная последовательность энхансеров была способна стимулировать повышенную экспрессию трансгена, например, в контексте массово параллельного репортерного анализа (MPRA). MPRAs предлагают мощное расширение этих методов для одновременного тестирования до тысяч потенциальных энхансеров активности и были подробно описаны в исследованиях геномики 12,27,34,35,36. Более высокая пропускная способность скрининга достигается за счет выполнения этапов клонирования, упаковки, доставки и секвенирования для потенциальных усилителей в партии, а не по отдельности.
Выбор усилителя кандидата предоставляет еще одну возможность для гибкости (рисунок 2D). Например, этот анализ может быть использован для идентификации энхансеров определенного гена, для определения функции интересующих некодирующих областей ДНК или для определения конкретных типов клеток или стадий развития, во время которых активен энхансер - все это служит целям как в фундаментальной науке, так и в исследованиях заболеваний. Как правило, выбор энхансера-кандидата обусловлен in silico предсказаниями активности энхансера. Как правило, прогнозы in silico включают ChIP-seq для модификаций гистонов, которые указывают на вероятные энхансеры, такие как H3K27ac37 и картирование доступности хроматина38. Наконец, растущей областью исследований является функциональный скрининг синтетически разработанных энхансерных элементов, позволяющий изучать, как последовательность энхансеров направляет функцию39 , и дизайн усилителей с конкретными свойствами40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Энхансеры являются связывающими платформами для разнообразного набора факторов транскрипции, которые управляют специфическими паттернами экспрессии ткане- и клеточных генов. Многочисленные средства оценки некодирующей ДНК и различных состояний хроматина оказались полезными для прогнозирования наличия энхансерных последовательностей в геноме, но проверка активности этих последовательностей и поиск органов и стадий развития, в которых они активны, является трудоемким процессом. Недавние достижения в области переносчиков аденоассоциированного вируса (AAV) позволили широко доставить трансгены в ткани мыши, что позволило проводить тестирование усилителей in vivo без необходимости трансгенного животного. Этот протокол показывает, как репортерная конструкция, которая выражает EGFP под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значительным выражением, может быть использована для изучения паттернов активности последовательностей-усилителей кандидатов в мозге мыши. Упакованную AAV конструкцию репортера доставляют в мозг мыши и инкубируют в течение 1-4 недель, после чего животное приносят в жертву, а участки мозга наблюдают под микроскопом. EGFP появляется в клетках, в которых тестируемого энхансера достаточно для инициирования экспрессии генов, точно определяя местоположение и стадию развития, на которой энхансер активен в мозге. Стандартные методы клонирования, недорогая упаковка AAV и расширение серотипов AAV и методов доставки in vivo и стандартного считывания изображений делают этот подход доступным для изучения того, как экспрессия генов регулируется в мозге.

Используя эти методы, последовательность 915 bp в связанном с психиатрическим риском третьем интроне гена CACNA1C 19,49,50 была протестирована на энхансерную активность в постнатальном мозге мыши. Эта последовательность была обнаружена в...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Этот протокол описывает новый анализ переходного энхансера-репортера на основе rAAV. Этот анализ может быть использован для индуцирования экспрессии in vivo, управляемой энхансерами, в мозге мыши.

AAV Развертывание конструктов экспрессии на основе энхансеров In Vivo в мозге мыши

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Этот протокол важен, потому что он позволяет визуализировать не только то, может ли последовательность усилителя управлять экспрессией, но и то, где она может управлять экспрессией в определенной части тела. Это быстро. Инъекции занимают менее 10 минут, а экспрессируется ли и где экспрессируется ген репортера, можно увидеть всего за несколько дней после сбора образца.Чтобы начать клонирование, выберите или спроектируйте конструкцию репортера. Конструкция, используемая здесь, помещает кандидата на энхансер в три основные непереведенные области репортерского гена EGFP, экспрессируемого под контролем минимального промотора hsp68. Чтобы спроектировать праймеры ПЦР для усиления интересующей последовательности и клонирования в вектор, добавьте соответствующий гомологический рычаг для клонирования Гибсона к пяти основным концам праймеров.Используя разработанные праймеры, выполните ПЦР из образца ДНК. Переваривайте от одного до 10 микрограммов векторной ДНК с помощью Pac1 и Asc1, в зависимости от желаемого количества необходимых реакций клонирования. Используя электрофорез от 0,7 до 1% геля в течение 30-60 минут при 100 вольтах, отделите фрагменты рестрикции переваривания.Извлеките полосу для линеаризованного вектора и очистите ее с помощью коммерческого набора для экстракции геля. Как только клонирование Гибсона и трансформация клеток завершены, помечайте клетки на селективные среды и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. После проверки успешного клонирования конструкции репортера привите пять миллилитров закваски с использованием глицеринового запаса.Выращивайте культуру в течение восьми-16 часов в встряхивающемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия и 180 оборотах в минуту. Когда бульон станет мутным, разбавьте заквасочную культуру в 1000 раз в 250-300 миллилитрах свежего селективного бульона LB и высиживайте его на ночь в встряхивающемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия и 180 оборотах в минуту. Используя коммерческий плазмидный макси-набор, очистите плазмиду.Чтобы проверить рекомбинацию ITR, выполните переваривание Xma1. Визуализируйте полосы. Убедитесь, что ваш дайджест показывает ожидаемое количество полос.Рекомбинация приведет к меньшему количеству полос, чем ожидалось. Готовят к поставке рекомбинантную смесь ААВ. При сравнении паттернов экспрессии нескольких вирусов-репортеров энхансеров разбавьте каждый вирус, чтобы приравнять титры вируса к наименее концентрированному вирусу.Смешайте энхансерный репортерный вирус и конститутивно экспрессируемый контрольный репортерный вирус в соотношении два к одному или три к одному. Добавьте небольшое количество быстрого зеленого красителя с конечной концентрацией 0,06% Разбейте кончик вытянутой стеклянной пипетки, изготовленной из капиллярной трубки с микролитровой градуировкой, аккуратно проткнув ее в нежную, безворсовую салфетку. Вставьте пипетку в аспираторный узел с помощью устройства для подачи давления, соединенного с резиновой прокладкой для удержания микрокапиллярной пипетки.Втяните небольшой объем от 0,2 до 0,5 микролитра минерального масла в пипетку, применяя отрицательное давление через аспиратор. Держите аспиратор в стороне и поместите вирус на лед, пока он не будет готов к инъекции. После криоанестезирования неонатальных мышей примените отрицательное давление с помощью аспиратора в сборе и втяните вирусную смесь в вытянутую стеклянную пипетку, пока мениск не пройдет отметку в два микролитра.Выньте мышь из холодной камеры и поместите ее на столешницу. Найдите места двусторонней инъекции на полпути между лямбдой и брегмой, а также сагиттальный шов и каждый глаз. Продезинфицируйте их с помощью спиртовой салфетки.Проткните череп неонатальных мышей с помощью вытянутой стеклянной пипетки. Когда игла входит в череп, приложите положительное давление через аспираторный узел. Распределите один микролитр вируса в боковой желудочек и извлеките пипетку.Поместите мышь на грелку или согревающую камеру для восстановления. Верните животное в домашнюю клетку после пробуждения. Записывайте флуоресцентные изображения, проходящие через участок мозга, используя 5-кратную субъективную линзу с низким увеличением.Определив место инъекции, оцените степень трансдукции вируса в зависимости от плотности и интенсивности красных флуоресцентных клеток. Сравните животных, которые были трансдуцированы аналогичным образом. Записывайте флуоресцентные изображения с объективом с более высоким увеличением более чем в 25 раз.Затем откройте программное обеспечение для анализа и примените медианный фильтр «три на три» для снижения шума. Нажмите на меню «Процесс», затем нажмите «Шум» и выберите опцию «Деспекл». Далее, чтобы вычесть фоновую флуоресценцию из изображений, начните с разделения каналов многоканального изображения.Нажмите на меню «Изображение», затем нажмите «Цвет» и выберите опцию «Разделить каналы». С помощью инструмента выделения «Прямоугольник» или «Круг» нарисуйте небольшую фигуру в области изображения без флуоресцентных ячеек. Измерьте среднюю интенсивность пикселей фона, щелкнув «Анализировать», а затем «Измерить», и повторите выборку несколько раз.Усредните среднее значение серого цвета от пяти до восьми фоновых областей и удалите десятичные значения. Вычтите значения из каждого пикселя изображения, выбрав меню «Процесс», затем выберите «Математика и вычитание». Затем введите фоновое значение для вычитания и нажмите кнопку ОК. При необходимости объедините каналы обратно в многоканальное изображение, выбрав меню «Изображение», затем нажмите «Цвет» и выберите «Объединить каналы».Чтобы подсчитать количество зеленых флуоресцентных клеток, скройте зеленый канал и нарисуйте форму вокруг области мозга, выражающую красную флуоресценцию, с помощью инструмента выделения свободной формы. Нажмите на функцию Измерить, чтобы измерить площадь, интегрированную плотность и среднее значение серого красного канала в выбранной зоне. Подсчитайте количество зеленых ячеек с помощью инструмента многоточечного выделения и нормализуйте количество зеленых ячеек по интегральной интенсивности красного канала.После трансдукции репортера энхансера, который мышь вводила интракрационно в P0 с положительной конструкцией AAV, показал экспрессию EGFP, управляемую энхансером, в средних нижних слоях коры через 28 дней после инъекции. Мышь, которой вводили отрицательную контрольную конструкцию при P0, не показывает никакой экспрессии EGFP через 28 дней после инъекции, демонстрируя, что энхансерные элементы управляют транскрипцией EGFP в мозге мыши. Для визуализации успешно трансдуцированной области и контроля потенциальной изменчивости были исследованы библиотеки репортеров усилителей AAV различных титров.Библиотека усилителей-кандидатов с высоким титром обеспечивает широкую экспрессию EGFP, в то время как библиотека усилителей-кандидатов с более низким титром стимулирует разреженную экспрессию CGFP в мозге мыши P7. Очень важно смешивать репортер энхансера AAV с положительным контролем при каждой инъекции, чтобы различать энхансеры без активности и неудачные роды. Эта процедура может быть сопряжена с иммуногистохимией, РНК FISH или секвенированием одноклеточной РНК, чтобы определить, в каких типах клеток активен энхансер.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Очистка сосудов головного мозга мыши

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-опосредованной Transgene экспрессия химерных конструктов для изучения поведенческой Функция GPCR гетеромеров у мышей

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

В естественных условиях Целевые выражение Optogenetic белков с помощью шелка/AAV фильмы

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Транспупиллярная двухфотонная визуализация сетчатки мыши In vivo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Крысиная модель инфекции мозга EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...