Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
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La secuenciación se realizó en el UC Davis DNA Technologies Core. Agradecemos al laboratorio de Lin Tian en UC Davis por la capacitación en el empaque de rAAV y por regalarnos generosamente plásmidos de AAV helper y rep / cap. Este trabajo fue apoyado por NIH/NIGMS R35GM119831.

Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Davis (Protocolo #22339) y el Comité Institucional de Bioseguridad de UC Davis (BUA-R1903). Este protocolo ha sido probado en ratones C57BL/6J de ambos sexos en el día postnatal 0-1.
1. Clone la secuencia candidata potenciadora en el plásmido vectorial AAV.
NOTA: Se dan los protocolos representativos, pero la estrategia de clonación tiene un alto grado ...

Este protocolo describe un método basado en rAAV para el despliegue de transgenes impulsados por potenciadores en el cerebro postnatal del ratón. En este protocolo generalizado, un potenciador candidato, un promotor mínimo, un gen reportero y una secuencia de código de barras opcional se clonan en una columna vertebral de plásmidos AAV. Estos experimentos se pueden hacer con una sola secuencia potenciadora candidata o con muchas secuencias en paralelo. El plásmido se empaqueta en un rAAV y se administra al cerebro ...

Los potenciadores son elementos genómicos cis-reguladores que sirven como sitios de unión al factor de transcripción y pueden conducir la expresión de un gen diana de una manera espacio-temporal específica 1,2. Son diferencialmente activos en diferentes tipos celulares, tejidos y etapas de desarrollo y pueden ser sustratos de variación genómica relacionada con el riesgo de enfermedad 3,4. Por lo tanto, la necesidad de comprender la dinámica de la función potenciadora es fundamental para el progreso en las aplicaciones de la ciencia traslacional y básica dentro de la genómica. Las predicciones in silico de la actividad potenciadora pueden servir como excelentes recursos para generar hipótesis en cuanto a la capacidad potenciadora 5,6. Tal actividad potenciadora predicha puede requerir validación e interrogación adicionales para una comprensión completa de la actividad funcional. Los ensayos de Enhancer Reporter han demostrado ser valiosos para este propósito en una variedad de sistemas, desde células hasta animales 7,8,9. Con miras a extender estos estudios en un contexto transitorio in vivo flexible y rentable, este protocolo describe el uso de métodos in vivo basados en AAV para probar secuencias potenciadoras putativas por su capacidad para impulsar la expresión de un gen reportero ectópico en el cerebro postnatal del ratón. Esta familia de métodos tiene utilidad para interrogar secuencias candidatas individuales o cribado paralelo de bibliotecas y es relevante para la investigación básica y traslacional.
Este método combina en un solo plásmido una secuencia de ADN candidato potenciador putativo con un gen reportero (aquí EGFP), bajo el control de un promotor mínimo que por sí solo no impulsa una expresión significativa. El plásmido se empaqueta en AAV recombinante (rAAV) y se inyecta en un modelo animal. Si bien la aplicación aquí es al cerebro, varios serotipos de rAAV permiten la infección a través de diferentes tipos de tejidos, de modo que este enfoque puede extenderse a otros sistemas10. Después de un período de tiempo, el cerebro puede ser recolectado y ensayado para la expresión del gen reportero. La expresión fuerte, en comparación con los controles, indica que la secuencia candidata probada fue capaz de "mejorar" la expresión del gen (Figura 1). Este diseño simple ofrece un enfoque fácil y claro para probar una secuencia de actividad potenciadora in vivo en el cerebro.
Además de probar la capacidad potenciadora de una secuencia, este método se puede combinar con técnicas para determinar la actividad potenciadora del tipo celular. En los enfoques basados en secuencias para determinar la actividad potenciadora diferencial, la clasificación de células en marcadores específicos de tipo celular antes de la secuenciación de ADN y ARN puede permitir a los investigadores determinar si diferentes tipos de células muestran actividad potenciadora diferencial, como se describió en Gisselbrecht et al.11. En los enfoques basados en imágenes, el etiquetado conjunto de imágenes con marcadores específicos del tipo de célula permite examinar si las células que exhiben fluorescencia impulsada por potenciadores también muestran marcadores de tipo celular de interés 12,13,14,15,16. Los ensayos de reportero de potenciadores permiten realizar pruebas directas de la variación alélica asociada al riesgo en los potenciadores para detectar efectos sobre la capacidad del potenciador. La gran mayoría de los loci de riesgo identificados en los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) se encuentran en regiones no codificantes del genoma17. Los estudios de anotación funcional de estos loci de riesgo indican que una gran parte probablemente actúa como potenciadores18,19,20. El despliegue de MPRA in vivo puede permitir probar estas variantes asociadas al riesgo para la actividad potenciadora en el cerebro12,21. Finalmente, la entrega y la recolección en diferentes puntos de tiempo pueden ofrecer información sobre las etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo.
Los diseños de plásmidos potenciadores-reporteros son diversos y se pueden personalizar para adaptarse a los objetivos experimentales. Hay varias opciones para promotores mínimos que se han utilizado en la investigación de potenciadores, como el promotor mínimo de β-globinahumana 22 y el promotor mínimo de ratón Hsp6823. Se sabe que estos promotores impulsan bajos niveles de expresión a menos que se combinen con un elemento potenciador para activarlos. En contraste, los elementos promotores constitutivos impulsan la expresión fuerte del transgén, útil para el control positivo o para probar la función potenciadora en un contexto de expresión robusta. Las opciones comunes para los promotores constitutivos incluyen CAG, un promotor híbrido derivado del promotor de β actina de pollo y el potenciador inmediato temprano del citomegalovirus24, o EF1α25 humano. Dado que se sabe que los potenciadores funcionan bidireccionalmente26, la orientación y la ubicación del potenciador en relación con el promotor mínimo son flexibles (Figura 2A). Los ensayos tradicionales de potenciador-reportero colocan el potenciador aguas arriba del promotor y, en las entregas de la biblioteca, incluyen una secuencia de código de barras aguas abajo del gen reportero para asociar las lecturas de secuenciación con el potenciador probado27. Sin embargo, los potenciadores también se pueden colocar en el marco de lectura abierto del gen reportero y servir como su propia secuencia de código de barras, como se hace en STARR-seq28. El protocolo descrito aquí utiliza el diseño del ensayo STARR-seq, colocando la secuencia del potenciador candidato en el UTR 3' del gen reportero. Si bien la orientación STARR-seq ofrece el beneficio de una clonación más simplificada, es menos conocida que el enfoque convencional y puede inducir una estabilidad variable del ARN entre las construcciones. Los métodos descritos pueden adaptarse fácilmente a la orientación STARR-seq o convencional con alteraciones menores en el proceso de clonación que se han descrito en otra parte27,29.
Se pueden emplear diferentes métodos de administración de AAV para personalizar aún más esta técnica para que se ajuste a los objetivos experimentales (Figura 2B). Las inyecciones intracraneales directas, descritas más adelante en este protocolo, entregan una alta concentración de virus directamente al cerebro30. Esto proporciona una alta eficiencia de transducción centrada en el sitio de inyección, lo que la convierte en una excelente técnica para experimentos que buscan maximizar la densidad de las células transducidas sobre un área de tejido. La inyección estereotáctica puede ayudar a estandarizar el sitio de inyección en animales para la transducción localizada reproducible. Las inyecciones intracraneales son más sencillas en animales postnatales tempranos. Como técnica alternativa, las inyecciones sistémicas pueden entregar transgenes utilizando AAVs con serotipos capaces de cruzar la barrera hematoencefálica31. Las inyecciones en las venas de la cola permiten que el virus circule por todo el cuerpo, lo que permite la administración generalizada a través de muchos tejidos10. Las inyecciones retroorbitarias son otra técnica de inyección sistémica que libera el virus detrás del ojo en el seno retroorbitario32. Esto ofrece una ruta más directa para el AAV desde el sistema venoso hasta el cerebro, resultando en una mayor concentración de células transducidas en el cerebro que las inyecciones en vasos sanguíneos más periféricos33.
Otro aspecto flexible de esta técnica es el método de lectura. En términos generales, las opciones pueden describirse como basadas en reporteros o en secuenciación (Figura 2C). La incorporación de un reportero fluorescente como GFP en el marco de lectura abierto del constructo da como resultado la expresión de la proteína fluorescente en cualquier célula transducida donde el potenciador candidato impulsó la expresión. Las técnicas de etiquetado e imagen, como la inmunohistoquímica, permiten la amplificación de la señal. Las técnicas de lectura basadas en la secuenciación implican la identificación de secuencias de la construcción entregada en ARN recolectado del tejido. Al cuantificar la cantidad de ADN viral que se entregó inicialmente, la comparación del ARN expresado versus el ADN entregado se puede utilizar para determinar el grado en que una secuencia potenciadora probada fue capaz de impulsar una mayor expresión del transgén, por ejemplo, en el contexto de un ensayo de reportero masivamente paralelo (MPRA). Los MPRA ofrecen una poderosa expansión de estas técnicas para probar hasta miles de potenciadores candidatos para la actividad simultáneamente y se han descrito ampliamente en la investigación genómica 12,27,34,35,36. Se logra una mayor detección de rendimiento mediante la ejecución de pasos de clonación, empaquetado, entrega y secuenciación para los potenciadores candidatos en lotes en lugar de individualmente.
La selección del potenciador candidato ofrece otra oportunidad para la flexibilidad (Figura 2D). Por ejemplo, este ensayo se puede utilizar para identificar potenciadores de un gen específico, para determinar la función de las regiones de interés del ADN no codificante, o para determinar tipos específicos de células o etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo, todo lo cual sirve para objetivos tanto en la ciencia básica como en la investigación de enfermedades. En general, la selección del potenciador candidato está impulsada por predicciones in silico de la actividad del potenciador. Comúnmente, las predicciones in silico incluyen ChIP-seq para modificaciones de histonas que indican potenciadores probables, como H3K27ac37 y mapeo de accesibilidad de cromatina38. Finalmente, un área de investigación creciente es el cribado basado en funciones de elementos potenciadores diseñados sintéticamente, lo que permite estudios de cómo la secuencia de potenciadores dirige la función39 y el diseño de potenciadores con propiedades específicas40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Los potenciadores son plataformas de unión para una amplia gama de factores de transcripción que impulsan patrones de expresión específicos de genes específicos de tejidos y tipos de células. Múltiples medios para evaluar el ADN no codificante y varios estados de cromatina han demostrado ser útiles para predecir la presencia de secuencias potenciadoras en el genoma, pero validar la actividad de estas secuencias y encontrar los órganos y las etapas de desarrollo en las que están activos es un proceso laborioso. Los avances recientes en vectores de virus adenoasociados (AAV) han permitido la entrega generalizada de transgenes a tejidos de ratón, lo que permite realizar pruebas de potenciadores in vivo sin necesidad de un animal transgénico. Este protocolo muestra cómo una construcción reportera que expresa EGFP bajo el control de un promotor mínimo, que no impulsa una expresión significativa por sí sola, puede usarse para estudiar los patrones de actividad de las secuencias de potenciadores candidatos en el cerebro del ratón. Una construcción de reportero empaquetada con AAV se entrega al cerebro del ratón y se incuba durante 1-4 semanas, después de lo cual se sacrifica al animal y se observan secciones cerebrales bajo un microscopio. EGFP aparece en células en las que el potenciador probado es suficiente para iniciar la expresión génica, señalando la ubicación y la etapa de desarrollo en la que el potenciador está activo en el cerebro. Los métodos de clonación estándar, el empaquetado de AAV de bajo costo y la expansión de los serotipos de AAV y los métodos para la administración in vivo y la lectura de imágenes estándar hacen de este un enfoque accesible para el estudio de cómo se regula la expresión génica en el cerebro.

Usando estos métodos, se probó una secuencia de 915 pb en el tercer intrón asociado al riesgo psiquiátrico del gen CACNA1C19,49,50 para determinar la actividad potenciadora en el cerebro postnatal del ratón. Esta secuencia fue descubierta en un MPRA de 345 secuencias candidatas potenciadoras centradas en SNPs de riesgo psiquiátrico y neurológico12 y los experimentos de caracterización se ...

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AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Este protocolo describe un nuevo ensayo de potenciador transitorio-reportero basado en rAAV. Este ensayo se puede utilizar para inducir la expresión impulsada por potenciadores in vivo en el cerebro del ratón.

Despliegue de AAV de construcciones de expresión basadas en potenciadores in vivo en cerebro de ratón

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Este protocolo es significativo porque permite la visualización no solo de si una secuencia potenciadora puede impulsar la expresión, sino también dónde puede impulsar la expresión en una parte particular del cuerpo. Es rápido. Las inyecciones tardan menos de 10 minutos en completarse, y si se expresa y dónde se expresa un gen reportero se puede ver a los pocos días de la recolección de la muestra.Para comenzar la clonación, elija o diseñe una construcción de reportero. La construcción utilizada aquí coloca al candidato potenciador en las tres regiones principales no traducidas de un gen reportero EGFP expresado bajo el control del promotor mínimo hsp68. Para diseñar los cebadores de PCR para amplificar una secuencia de interés y clonar en el vector, agregue el brazo de homología apropiado para la clonación de Gibson al extremo principal de los cinco cebadores.Usando los cebadores diseñados, realice PCR a partir de una muestra de ADN. Digiera de uno a 10 microgramos de ADN vectorial usando Pac1 y Asc1, dependiendo del número deseado de reacciones de clonación requeridas. Mediante el empleo de electroforesis en gel de 0,7 a 1% durante 30 a 60 minutos a 100 voltios, separe los fragmentos de digestión de restricción.Extraiga la banda para el vector lineal y purifíquela con un kit de extracción de gel comercial. Una vez que se complete la clonación de Gibson y la transformación de las células, coloque las células en medios selectivos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Después de verificar la clonación exitosa de la construcción del reportero, inocule cinco mililitros del cultivo iniciador utilizando el stock de glicerol.Cultive el cultivo durante ocho a 16 horas en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 180 rotaciones por minuto. A medida que el caldo se vuelve turbio, diluya el cultivo iniciador 1, 000x en 250 a 300 mililitros de caldo LB selectivo fresco, e incube durante la noche en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 180 rotaciones por minuto. Usando un maxi kit comercial de plásmidos, purifica el plásmido.Para probar la recombinación de los ITR, realice una digestión Xma1. Visualiza las bandas. Asegúrese de que su resumen muestre el número esperado de bandas.La recombinación dará como resultado menos bandas de las esperadas. Prepare la mezcla recombinante de AAV para la entrega. Si compara los patrones de expresión de múltiples virus reporteros potenciadores, diluya cada virus para equiparar los títulos de virus al virus menos concentrado.Mezcle el virus reportero potenciador y el virus reportero de control expresado constitutivamente en una proporción de dos a uno o tres a uno. Agregue una pequeña cantidad de tinte verde rápido con una concentración final de 0.06%Rompa la punta de una pipeta de vidrio tirada hecha de un tubo capilar graduado de microlitro perforándola suavemente en una toallita delicada y sin pelusa. Inserte la pipeta en un conjunto de aspirador con un dispositivo de aplicación de presión conectado a una junta de goma para sostener una pipeta microcapilar.Extraiga un pequeño volumen de alrededor de 0,2 a 0,5 microlitros de aceite mineral en la pipeta aplicando presión negativa a través del aspirador. Mantenga el conjunto del aspirador a un lado y coloque el virus en hielo hasta que esté listo para inyectarse. Después de crioanestesiar a los ratones neonatos, aplique presión negativa con el conjunto del aspirador y extraiga la mezcla de virus en la pipeta de vidrio tirado hasta que el menisco pase la marca de dos microlitros.Retire el ratón de la cámara fría y colóquelo en la parte superior del banco. Localice los sitios de inyección bilateral a medio camino entre lambda y bregma, así como la sutura sagital y cada ojo. Desinfectarlos con una toallita con alcohol.Perforar el cráneo de los ratones neonatos con la pipeta de vidrio tirado. A medida que la aguja entra en el cráneo, aplique una presión positiva a través del conjunto del aspirador. Dispensar un microlitro del virus en el ventrículo lateral y retirar la pipeta.Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica o una cámara de calentamiento para recuperarse. Devuelva al animal a la jaula de la casa una vez despertado. Grabe imágenes de fluorescencia que atraviesan la sección del cerebro utilizando una lente subjetiva de bajo aumento 5x.Al localizar el sitio de inyección, evalúe el alcance de la transducción del virus, dependiendo de la densidad e intensidad de las células fluorescentes rojas. Compare los animales que fueron transducidos de manera similar. Grabe imágenes fluorescentes con una lente objetivo de mayor aumento de más de 25x.A continuación, abra el software de análisis y aplique un filtro mediano de tres por tres para reducir el ruido. Haga clic en el menú Proceso, luego haga clic en Ruido y elija la opción Desspeckle. A continuación, para restar la fluorescencia de fondo de las imágenes, comience separando los canales de una imagen multicanal.Haga clic en el menú Imagen, luego haga clic en Color y seleccione la opción Dividir canales. Con la herramienta de selección de rectángulos o círculos, dibuje una forma pequeña en un área de la imagen sin celdas fluorescentes. Mida la intensidad de píxeles promedio del fondo haciendo clic en Analizar y luego en Medir, y repita para muestrear varias veces.Promedie el valor gris medio de cinco a ocho áreas de fondo y elimine los valores decimales. Resta los valores de cada píxel de la imagen seleccionando el menú Proceso y, a continuación, haz clic en Matemáticas y restar. A continuación, introduzca el valor de fondo que desea restar y haga clic en Aceptar. Si es necesario, vuelva a combinar los canales en una imagen multicanal seleccionando el menú Imagen, luego haga clic en Color y seleccione Combinar canales.Para contar el número de células fluorescentes verdes, oculte el canal verde y dibuje una forma alrededor de la región del cerebro que exprese fluorescencia roja utilizando la herramienta de selección de forma libre. Haga clic en la función Medir para medir el área, la densidad integrada y el valor gris medio del canal rojo en la zona seleccionada. Cuente el número de celdas verdes utilizando una herramienta de selección de varios puntos y normalice el número de celdas verdes por la intensidad integrada del canal rojo.Después de transducir el informe potenciador que el ratón inyectado intracranealmente en P0 con una construcción positiva de AAV mostró expresión de EGFP impulsada por potenciadores en las capas inferiores medias de la corteza 28 días después de la inyección. El ratón inyectado con una construcción de control negativo en P0 no muestra ninguna expresión de EGFP 28 días después de la inyección, lo que demuestra que los elementos potenciadores se encuentran para impulsar la transcripción de EGFP en el cerebro del ratón. Para visualizar el área transducida con éxito y controlar la variabilidad potencial, se examinaron las bibliotecas de reporteros potenciadores entregados por AAV de diferentes títulos.La biblioteca de títulos altos de potenciadores candidatos impulsa una amplia expresión de EGFP, mientras que la biblioteca de títulos más bajos de potenciadores candidatos impulsa la expresión dispersa de CGFP en el cerebro del ratón P7. Es vital mezclar el reportero potenciador AAV con el control positivo en cada inyección para distinguir entre potenciadores sin actividad y entregas fallidas. Este procedimiento se puede combinar con inmunohistoquímica, ARN FISH o secuenciación de ARN de una sola célula para determinar en qué tipos de células está activo un potenciador.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Investigación

Neurociencias

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

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HSV mediada por la expresión transgénica de constructos quiméricos para estudiar la función del comportamiento de los GPCR heterómeros en ratones

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

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In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

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A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

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It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

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