Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

Sekvensering utfördes vid UC Davis DNA Technologies Core. Vi tackar Lin Tians laboratorium vid UC Davis för utbildning i rAAV-förpackningar och generöst gav oss AAV-hjälpare och rep / cap-plasmider. Detta arbete stöddes av NIH/NIGMS R35GM119831.

Detta protokoll har godkänts av UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #22339) och UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Detta protokoll har testats på C57BL/6J-möss av båda könen vid postnatal dag 0-1.
1. Klona förstärkarkandidatsekvensen i AAV-vektorplasmiden.
OBS: De representativa protokollen ges, men kloningsstrategin har en hög grad av flexibilitet.
<ol><li>Välj eller designa en reporterkon...

Detta protokoll beskriver en rAAV-baserad metod för distribution av förstärkardrivna transgener i den postnatala mushjärnan. I detta generaliserade protokoll klonas en kandidatförstärkare, en minimal promotor, en reportergen och en valfri streckkodssekvens till en AAV-plasmidstamnät. Dessa experiment kan göras med en enda kandidatförstärkarsekvens eller med många sekvenser parallellt. Plasmiden förpackas i en rAAV och levereras till den postnatala mushjärnan. Efter en tid för att möjliggöra virustransdukt...

Förstärkare är genomiska cis-reglerande element som fungerar som transkriptionsfaktorbindningsställen och kan driva uttrycket av en målgen på ett spatiotemporalt specifikt sätt 1,2. De är differentiellt aktiva i olika celltyper, vävnader och utvecklingsstadier och kan vara substrat för sjukdomsriskrelaterad genomisk variation 3,4. Således är behovet av att förstå dynamiken i förstärkarfunktionen avgörande för framsteg i både translationella och grundläggande vetenskapliga tillämpningar inom genomik. In silico förutsägelser av förstärkare aktivitet kan fungera som utmärkta resurser för att generera hypoteser om att förbättra förmågan 5,6. Sådan förutsagd förstärkaraktivitet kan kräva ytterligare validering och förhör för en fullständig förståelse av den funktionella aktiviteten. Enhancer reporter analyser har visat sig vara värdefulla för detta ändamål i en mängd olika system, från celler till djur 7,8,9. För att utöka dessa studier i ett flexibelt och kostnadseffektivt övergående in vivo-sammanhang beskriver detta protokoll användningen av in vivo AAV-baserade metoder för att testa förmodade förstärkarsekvenser för deras förmåga att driva uttrycket av en ektopisk reportergen i den postnatala mushjärnan. Denna familj av metoder har nytta för att förhöra enstaka kandidatsekvenser eller parallell biblioteksscreening och är relevant för grundläggande och translationell forskning.
Denna metod kombinerar i en enda plasmid en förmodad förstärkarkandidat-DNA-sekvens med en reportergen (här EGFP), under kontroll av en minimal promotor som ensam inte driver signifikant uttryck. Plasmiden förpackas i rekombinant AAV (rAAV) och injiceras i en djurmodell. Medan applikationen här är till hjärnan, möjliggör olika rAAV-serotyper infektion över olika vävnadstyper så att detta tillvägagångssätt kan utvidgas till andra system10. Efter en tid kan hjärnan samlas in och analyseras för uttrycket av reportergenen. Starkt uttryck, jämfört med kontroller, indikerar att den testade kandidatsekvensen kunde "förbättra" uttrycket av genen (figur 1). Denna enkla design erbjuder ett enkelt och tydligt tillvägagångssätt för att testa en sekvens för att förbättra aktiviteten in vivo i hjärnan.
Förutom att testa för att förbättra förmågan hos en sekvens kan denna metod kombineras med tekniker för att bestämma cellförstärkande aktivitet. I sekvensbaserade metoder för att bestämma differentiell förstärkaraktivitet kan sortering av celler på celltypspecifika markörer före DNA- och RNA-sekvensering göra det möjligt för forskare att avgöra om olika celltyper visar differentiell förstärkaraktivitet, vilket beskrevs i Gisselbrecht et al.11. I avbildningsbaserade tillvägagångssätt möjliggör sammärkning av bilder med celltypspecifika markörer undersökning av om celler som uppvisar förstärkardriven fluorescens också visar celltypmarkörer av intresse 12,13,14,15,16. Enhancer reporter analyser möjliggör direkt testning av risk-associerad allelisk variation i förstärkare för effekter på förstärkare kapacitet. Den stora majoriteten av de riskloki som identifierats i genomomfattande associeringsstudier (GWAS) ligger i icke-kodande regioner i genomet17. Funktionella annoteringsstudier av dessa riskloci indikerar att en stor del sannolikt fungerar som förstärkare18,19,20. MPRA-distribution in vivo kan möjliggöra testning av dessa riskassocierade varianter för förstärkaraktivitet i hjärnan12,21. Slutligen kan leverans och insamling vid olika tidpunkter ge insikter i de utvecklingsstadier under vilka en förstärkare är aktiv.
Förstärkare-reporter plasmiddesign är olika och kan anpassas för att passa experimentella mål. Det finns flera alternativ för minimala promotorer som har använts i förstärkarforskning, såsom den mänskliga β-globin minimala promotorn22 och musen Hsp68 minimal promotor23. Dessa promotorer är kända för att driva låga uttrycksnivåer om de inte kombineras med ett förstärkarelement för att aktivera dem. Däremot driver konstitutiva promotorelement starkt uttryck av transgenen, användbart för positiv kontroll eller för att testa för förstärkarfunktion mot en bakgrund av robust uttryck. Vanliga val för konstitutiva promotorer inkluderar CAG, en hybridpromotor som härrör från kyckling β-aktinpromotorn och cytomegaloviruset omedelbart tidigt förstärkare24, eller human EF1α25. Eftersom förstärkare är kända för att fungera dubbelriktat26 är förstärkarens orientering och placering i förhållande till den minimala promotorn flexibel (figur 2A). Traditionella förstärkare-reporteranalyser placerar förstärkaren uppströms promotorn och inkluderar i biblioteksleveranser en streckkodssekvens nedströms reportergenen för att associera sekvenseringsläsningar med den testade förstärkaren27. Men förstärkare kan också placeras i reportergenens öppna läsram och fungera som en egen streckkodssekvens, vilket görs i STARR-seq28. Protokollet som beskrivs här använder STARR-seq-analysdesignen och placerar kandidatförstärkarsekvensen i 3 'UTR för reportergenen. Medan STARR-seq-orienteringen erbjuder fördelen med mer strömlinjeformad kloning, är den mindre väl förstådd än det konventionella tillvägagångssättet och kan inducera variabel RNA-stabilitet mellan konstruktioner. De beskrivna metoderna kan enkelt anpassas till antingen STARR-seq eller konventionell orientering med mindre förändringar i kloningsprocessen som har beskrivits någon annanstans27,29.
Olika metoder för AAV-leverans kan användas för att ytterligare anpassa denna teknik för att passa experimentella mål (figur 2B). Direkta intrakraniella injektioner, som beskrivs vidare i detta protokoll, levererar en hög koncentration av virus direkt till hjärnan30. Detta ger en hög transduktionseffektivitet centrerad vid injektionsstället, vilket gör detta till en utmärkt teknik för experiment som vill maximera densiteten hos transducerade celler över ett vävnadsområde. Stereotaktisk injektion kan hjälpa till att standardisera injektionsstället över djur för reproducerbar lokaliserad transduktion. Intrakraniella injektioner är enklast hos tidiga postnatala djur. Som en alternativ teknik kan systemiska injektioner leverera transgener med hjälp av AAV med serotyper som kan korsa blod-hjärnbarriären31. Tail-ven-injektioner tillåter viruset att cirkulera i hela kroppen, vilket möjliggör generaliserad leverans över många vävnader10. Retro-orbitala injektioner är en annan systemisk injektionsteknik som levererar viruset bakom ögat till retro-orbital sinus32. Detta erbjuder en mer direkt väg för AAV från det venösa systemet till hjärnan, vilket resulterar i en högre koncentration av transducerade celler i hjärnan än injektioner i mer perifera blodkärl33.
En annan flexibel aspekt av denna teknik är metoden för avläsning. I stort sett kan alternativ beskrivas som reporterbaserade eller sekvenseringsbaserade (figur 2C). Att införliva en fluorescerande reporter som GFP i konstruktionens öppna läsram resulterar i uttrycket av det fluorescerande proteinet i alla transducerade celler där kandidatförstärkaren drev uttryck. Märknings- och avbildningstekniker som immunohistokemi möjliggör signalförstärkning. Sekvenseringsbaserade avläsningstekniker involverar identifiering av sekvenser från den levererade konstruktionen i RNA som samlats in från vävnaden. Genom att kvantifiera mängden viralt DNA som ursprungligen levererades kan jämförelsen av uttryckt RNA kontra levererat DNA användas för att bestämma i vilken grad en testad förstärkarsekvens kunde driva ökat uttryck av transgenen, till exempel i samband med en massivt parallell reporteranalys (MPRA). MPRA erbjuder en kraftfull utvidgning av dessa tekniker för att testa upp till tusentals kandidatförstärkare för aktivitet samtidigt och har beskrivits utförligt i genomikforskning 12,27,34,35,36. Screening av högre genomströmning uppnås genom att utföra klonings-, förpacknings-, leverans- och sekvenseringssteg för kandidatförstärkare i batch snarare än individuellt.
Val av kandidatförstärkare ger ytterligare en möjlighet till flexibilitet (figur 2D). Till exempel kan denna analys användas för att identifiera förstärkare av en specifik gen, för att fastställa funktionen hos icke-kodande DNA-regioner av intresse eller för att bestämma specifika celltyper eller utvecklingsstadier under vilka en förstärkare är aktiv - som alla tjänar mål både i grundvetenskap och i sjukdomsforskning. I allmänhet drivs valet av kandidatförstärkare av in silico-förutsägelser om förbättringsaktivitet. Vanligtvis inkluderar förutsägelser i silico ChIP-seq för histonmodifieringar som indikerar sannolika förstärkare, såsom H3K27ac37 och kromatin tillgänglighetskartläggning38. Slutligen är ett växande forskningsområde funktionsbaserad screening av syntetiskt utformade förstärkarelement, vilket möjliggör studier av hur förstärkarsekvensen styr funktion39 och design av förstärkare med specifika egenskaper40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Förstärkare är bindande plattformar för en mängd olika transkriptionsfaktorer som driver specifika uttrycksmönster för vävnads- och celltypspecifika gener. Flera sätt att bedöma icke-kodande DNA och olika kromatintillstånd har visat sig vara användbara för att förutsäga närvaron av förstärkarsekvenser i genomet, men att validera aktiviteten hos dessa sekvenser och hitta de organ och utvecklingsstadier de är aktiva i är en arbetsintensiv process. De senaste framstegen inom adenoassocierade virusvektorer (AAV) har möjliggjort utbredd leverans av transgener till musvävnader, vilket möjliggör in vivo-förstärkartestning utan att kräva ett transgent djur. Detta protokoll visar hur en reporterkonstruktion som uttrycker EGFP under kontroll av en minimal promotor, som inte driver betydande uttryck på egen hand, kan användas för att studera aktivitetsmönstren för kandidatförstärkare sekvenser i mushjärnan. En AAV-förpackad reporterkonstruktion levereras till mushjärnan och inkuberas i 1-4 veckor, varefter djuret offras och hjärnsektioner observeras under ett mikroskop. EGFP förekommer i celler där den testade förstärkaren är tillräcklig för att initiera genuttryck, vilket pekar på platsen och utvecklingsstadiet där förstärkaren är aktiv i hjärnan. Standardkloningsmetoder, billiga AAV-förpackningar och expanderande AAV-serotyper och metoder för in vivo-leverans och standardavbildningsavläsning gör detta till ett tillgängligt tillvägagångssätt för studier av hur genuttryck regleras i hjärnan.

Med hjälp av dessa metoder testades en 915 bp-sekvens i den psykiatriska riskassocierade tredje intronen av genen CACNA1C19,49,50 för förstärkande aktivitet i den postnatala mushjärnan. Denna sekvens upptäcktes i en MPRA av 345 kandidatförstärkarsekvenser centrerade på psykiatrisk och neurologisk risk SNPs12 och karakteriseringsexperiment beskrivs här som ett allmänt exempel. C57BL/6-m...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Detta protokoll beskriver en ny rAAV-baserad övergående förstärkare-reporteranalys. Denna analys kan användas för att inducera förstärkardrivet uttryck in vivo i mushjärnan.

AAV-distribution av förstärkarbaserade uttryckskonstruktioner in vivo i mushjärnan

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det möjliggör visualisering av inte bara om en förstärkarsekvens kan driva uttryck utan var det kan driva uttryck i en viss del av kroppen. Det går snabbt. Injektionerna tar mindre än 10 minuter att slutföra, och om och var en reportergen uttrycks kan ses inom bara några dagar efter provtagning.För att börja kloningen, välj eller designa en reporterkonstruktion. Konstruktionen som används här placerar förstärkarkandidaten i de tre främsta oöversatta regionerna i en EGFP-reportergen uttryckt under kontroll av hsp68-minimalpromotorn. För att designa PCR-primers för att förstärka en sekvens av intresse och kloning i vektorn, lägg till lämplig homologiarm för Gibson-kloning till de fem främsta ändarna av primersna.Använd de designade primersna, utför PCR från ett DNA-prov. Smält ett till 10 mikrogram vektor-DNA med Pac1 och Asc1, beroende på önskat antal kloningsreaktioner som krävs. Genom att använda 0,7 till 1% gelelektrofores i 30 till 60 minuter vid 100 volt, separera restriktionssmältfragmenten.Extrahera bandet för den linjäriserade vektorn och rena det med ett kommersiellt gelextraktionssats. När Gibson-kloningen och omvandlingen av celler är klar, platta cellerna på selektiva medier och inkubera över natten vid 37 grader Celsius. Efter att ha verifierat den framgångsrika kloningen av reporterkonstruktionen, inokulera fem milliliter av startkulturen med hjälp av glycerolbeståndet.Växa kulturen i åtta till 16 timmar i en skakande inkubator vid 30 grader Celsius och 180 rotationer per minut. När buljongen blir grumlig, späd startkulturen 1 000x i 250 till 300 ml färsk selektiv LB-buljong och inkubera den över natten i en skakande inkubator vid 30 grader Celsius och 180 rotationer per minut. Rengör plasmiden med hjälp av ett kommersiellt plasmid maxi-kit.För att testa för rekombination av ITR: erna, utför en Xma1-matsmältning. Visualisera banden. Se till att sammanfattningen visar det förväntade antalet band.Rekombination kommer att resultera i färre band än väntat. Förbered rekombinant AAV-blandning för leverans. Om du jämför uttrycksmönstren för flera förstärkare reportervirus, späd varje virus för att likställa virustitrarna med det minst koncentrerade viruset.Blanda förstärkarreporterviruset och konstitutivt uttryckt kontrollreportervirus i förhållandet två till en eller tre till en. Tillsätt en liten mängd snabbt grönt färgämne med en slutlig koncentration på 0,06%Bryt spetsen på en dragen glaspipett gjord av ett mikrolitergraderat kapillärrör genom att försiktigt genomborra det i en delikat, luddfri torkduk. Sätt in pipetten i en andningsenhet med en tryckapplicerande anordning ansluten till en gummipackning för att hålla en mikrokapillärpipett.Dra en liten volym på cirka 0,2 till 0,5 mikroliter mineralolja i pipetten genom att applicera undertryck genom aspiratoren. Håll aspiratorenheten åt sidan och placera viruset på is tills det är klart att injicera. Efter kryobedövning av neonatalmössen, applicera undertryck med hjälp av aspiratorenheten och dra virusblandningen i den dragna glaspipetten tills menisken passerar två-mikroliter tick-märket.Ta musen bort från kylkammaren och placera den på bänkskivan. Leta reda på de bilaterala injektionsställena halvvägs mellan lambda och bregma, liksom sagittal sutur och varje öga. Sanera dem med en alkoholtork.Pierce skallen på neonatalmössen med hjälp av den dragna glaspipetten. När nålen kommer in i skallen, applicera ett positivt tryck genom aspiratorenheten. Dispensera en mikroliter av viruset i sidokammaren och dra tillbaka pipetten.Placera musen på en värmedyna eller en uppvärmningskammare för att återhämta sig. Återlämna djuret till hemburet när det vaknat. Spela in fluorescensbilder som korsar hjärnsektionen med en låg förstoring 5x subjektiv lins.Genom att lokalisera injektionsstället, utvärdera omfattningen av virustransduktion, beroende på densiteten och intensiteten hos röda fluorescerande celler. Jämför de djur som transducerades på samma sätt. Spela in fluorescerande bilder med en objektiv med högre förstoringsmål på mer än 25x.Öppna sedan analysprogramvaran och applicera ett tre-till-tre medianfilter för att minska bruset. Klicka på Process-menyn, klicka sedan på Buller och välj alternativet Despeckle. Därefter, för att subtrahera bakgrundsfluorescensen från bilderna, börja med att separera kanalerna i en flerkanalig bild.Klicka på bildmenyn, klicka sedan på Färg och välj alternativet Dela kanaler. Använd rektangel- eller cirkelmarkeringsverktyget och rita en liten form i ett område i bilden utan några fluorescerande celler. Mät bakgrundens genomsnittliga pixelintensitet genom att klicka på Analysera och sedan Mät och upprepa för att ta prov flera gånger.Beräkna medelvärdet för gråvärdet i genomsnitt från fem till åtta bakgrundsområden och minska decimalvärdena. Subtrahera värdena från varje pixel i bilden genom att välja Process-menyn och klicka sedan på Matematik och Subtrahera. Ange sedan bakgrundsvärdet som ska subtraheras och klicka på OK. Om det behövs slår du samman kanalerna tillbaka till en flerkanalsbild genom att välja bildmenyn, klicka sedan på Färg och välj Slå samman kanaler.Om du vill räkna antalet gröna fluorescerande celler döljer du den gröna kanalen och ritar en form runt hjärnområdet som uttrycker röd fluorescens med hjälp av det fria markeringsverktyget. Klicka på mätfunktionen för att mäta området, den integrerade densiteten och medelvärdet för den röda kanalen i den valda zonen. Räkna antalet gröna celler med hjälp av ett flerpunktsmarkeringsverktyg och normalisera antalet gröna celler med den röda kanalens integrerade intensitet.Efter att ha transducerat förstärkaren reporter att musen injicerade intrakraniellt vid P0 med en positiv AAV-konstruktion visade förstärkardrivet EGFP-uttryck i de mellersta nedre skikten av cortex 28 dagar efter injektion. Musen som injiceras med en negativ kontrollkonstruktion vid P0 visar inget uttryck för EGFP 28 dagar efter injektionen, vilket visar att de förstärkande elementen visar sig driva transkription av EGFP i mushjärnan. För att visualisera det framgångsrikt transducerade området och kontrollera för potentiell variabilitet undersöktes AAV-levererade förstärkarreporterbibliotek med olika titrar.Det höga titerbiblioteket med kandidatförstärkare driver brett EGFP-uttryck medan det lägre titerbiblioteket för kandidatförstärkare driver glesa CGFP-uttryck i P7-mushjärnan. Det är viktigt att blanda förstärkarreportern AAV med den positiva kontrollen vid varje injektion för att skilja mellan förstärkare utan aktivitet och misslyckade leveranser. Denna procedur kan paras ihop med immunhistokemi, RNA FISH eller encells RNA-sekvensering för att bestämma vilka celltyper en förstärkare är aktiv i.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rening av Mouse Brain Fartyg

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-medierad transgenexpression av chimära konstruktioner för att studera Behavioral funktion GPCR Heteromers i möss

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Riktade uttrycket av Optogenetic proteiner med hjälp av Silk/AAV filmer

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillär tvåfotoner in vivo-avbildning av musens näthinna

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

En råttmodell av EcoHIV hjärninfektion

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...