Name: aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

UC Davis DNA Technologies Core'da dizileme yapıldı. UC Davis'teki Lin Tian laboratuvarına, rAAV ambalajı konusunda eğitim aldıkları ve bize AAV yardımcısı ve rep / cap plazmidlerini cömertçe hediye ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH/NIGMS R35GM119831 tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, UC Davis Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol #22339) ve UC Davis Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (BUA-R1903) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, doğum sonrası 0-1. günde her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri üzerinde test edilmiştir.
1. Arttırıcı aday dizisini AAV vektör plazmidine klonlayın.
NOT: Temsili protokoller verilmiştir, ancak klonlama stratejisi yüksek derecede esnekliğe sahiptir....

Bu protokol, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı güdümlü transgenlerin konuşlandırılması için rAAV tabanlı bir yöntemi açıklar. Bu genelleştirilmiş protokolde, bir aday arttırıcı, bir minimal destekleyici, bir muhabir geni ve isteğe bağlı bir barkod dizisi bir AAV plazmid omurgasına klonlanır. Bu deneyler tek bir aday arttırıcı dizisi ile veya paralel olarak birçok dizi ile yapılabilir. Plazmid bir rAAV içine paketlenir ve doğum sonrası fare beynine verilir. Virüs transdüksiyonuna i...

Arttırıcılar, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri olarak hizmet eden genomik cis-düzenleyici elemanlardır ve bir hedef genin ekspresyonunu mekansal olarak zamansal olarak spesifik bir şekilde yönlendirebilir 1,2. Farklı hücre tiplerinde, dokularda ve gelişim aşamalarında farklı şekilde aktiftirler ve hastalık riskine bağlı genomik varyasyonun substratları olabilirler 3,4. Bu nedenle, arttırıcı fonksiyonun dinamiklerini anlama ihtiyacı, genomik içindeki hem translasyonel hem de temel bilim uygulamalarında ilerleme için kritik öneme sahiptir. Arttırıcı aktivitenin In silico tahminleri, arttırıcı yetenek 5,6 ile ilgili hipotezler üretmek için mükemmel kaynaklar olarak hizmet edebilir. Bu tür öngörülen arttırıcı aktivite, fonksiyonel aktivitenin tam olarak anlaşılması için ek doğrulama ve sorgulama gerektirebilir. Enhancer muhabir tahlilleri, hücrelerden hayvanlara kadar çeşitli sistemlerde bu amaç için değerli olduğunu kanıtlamıştır 7,8,9. Bu çalışmaları esnek ve uygun maliyetli bir in vivo bağlamda genişletmeye yönelik olarak, bu protokol, doğum sonrası fare beyninde ektopik bir muhabir geninin ekspresyonunu sürme yetenekleri için varsayılan arttırıcı dizileri test etmek için in vivo AAV tabanlı yöntemlerin kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntem ailesi, tek aday dizileri veya paralel kütüphane taramasını sorgulamak için faydalıdır ve temel ve translasyonel araştırmalarla ilgilidir.
Bu yöntem, tek bir plazmidde, varsayılan bir arttırıcı aday DNA dizisini, tek başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen minimal bir promotörün kontrolü altında, bir muhabir geni (burada EGFP) ile birleştirir. Plazmid, rekombinant AAV'ye (rAAV) paketlenir ve bir hayvan modeline enjekte edilir. Buradaki uygulama beyne yapılırken, çeşitli rAAV serotipleri farklı doku tiplerinde enfeksiyona olanak tanır, böylece bu yaklaşım diğer sistemlere genişletilebilir10. Bir süre sonra, beyin toplanabilir ve muhabir geninin ifadesi için test edilebilir. Güçlü ifade, kontrollerle karşılaştırıldığında, test edilen aday dizisinin genin ekspresyonunu "geliştirebildiğini" gösterir (Şekil 1). Bu basit tasarım, beyindeki arttırıcı aktivite için bir diziyi test etmek için kolay ve net bir yaklaşım sunar.
Bir dizinin arttırıcı kabiliyetinin test edilmesine ek olarak, bu yöntem hücre tipi arttırıcı aktivitesini belirlemek için tekniklerle birleştirilebilir. Diferansiyel arttırıcı aktivitesini belirlemeye yönelik sekans tabanlı yaklaşımlarda, DNA ve RNA diziliminden önce hücreleri hücre tipine özgü belirteçler üzerinde sıralamak, araştırmacıların Gisselbrecht ve ark.11'de açıklandığı gibi, farklı hücre tiplerinin diferansiyel arttırıcı aktivite gösterip göstermediğini belirlemelerine izin verebilir. Görüntüleme tabanlı yaklaşımlarda, görüntülerin hücre tipine özgü belirteçlerle birlikte etiketlenmesi, arttırıcı güdümlü floresan sergileyen hücrelerin aynı zamanda ilgilenilen hücre tipi belirteçleri de gösterip göstermediğinin incelenmesine olanak tanır 12,13,14,15,16. Enhancer muhabir testleri, arttırıcılardaki riskle ilişkili allelik varyasyonun, arttırıcı kapasitesi üzerindeki etkileri açısından doğrudan test edilmesini sağlar. Genom çapında ilişkilendirme çalışmalarında (GWAS) tanımlanan risk lokuslarının büyük çoğunluğu, genomun kodlamayan bölgelerinde yatmaktadır17. Bu risk lokuslarının fonksiyonel ek açıklama çalışmaları, büyük bir kısmının muhtemelen arttırıcı olarak hareket ettiğini göstermektedir18,19,20. In vivo MPRA dağıtımı, beyindeki arttırıcı aktivite için bu riskle ilişkili varyantların test edilmesine izin verebilir12,21. Son olarak, farklı zaman noktalarında teslimat ve toplama, bir geliştiricinin aktif olduğu gelişim aşamaları hakkında içgörüler sunabilir.
Geliştirici-muhabir plazmid tasarımları çeşitlidir ve deneysel hedeflere uyacak şekilde özelleştirilebilir. Geliştirici araştırmalarında kullanılan minimal promotörler için insan β-globin minimal promotör22 ve fare Hsp68 minimal promoter23 gibi çeşitli seçenekler vardır. Bu destekleyicilerin, onları etkinleştirmek için bir geliştirici unsurla birleştirilmediği sürece düşük ifade seviyelerini yönlendirdiği bilinmektedir. Buna karşılık, kurucu promotör elemanlar, transgenin güçlü ekspresyonunu yönlendirir, pozitif kontrol için veya güçlendirici fonksiyonu sağlam bir ifadenin arka planına karşı test etmek için kullanışlıdır. Kurucu destekleyiciler için yaygın seçenekler arasında tavuk β aktin promotöründen türetilen hibrit bir promotör olan CAG ve sitomegalovirüs hemen-erken arttırıcı24 veya insan EF1α25 bulunur. Arttırıcıların çift yönlü olarak çalıştığı bilindiğinden26, arttırıcının minimum promotöre göre oryantasyonu ve konumu esnektir (Şekil 2A). Geleneksel geliştirici-muhabir analizleri, geliştiriciyi destekleyicinin yukarı akışını yerleştirir ve kütüphane teslimatlarında, sıralama okumalarını test edilen geliştirici27 ile ilişkilendirmek için muhabir geninin aşağı yönünde bir barkod dizisi içerir. Bununla birlikte, arttırıcılar muhabir geninin açık okuma çerçevesine de yerleştirilebilir ve STARR-seq28'de yapıldığı gibi kendi barkod dizileri olarak hizmet edebilir. Burada açıklanan protokol, STARR-seq tahlil tasarımını kullanır ve aday arttırıcı dizisini muhabir geninin 3' UTR'sine yerleştirir. STARR-seq oryantasyonu daha akıcı klonlamanın faydasını sunarken, geleneksel yaklaşımdan daha az anlaşılmıştır ve yapılar arasında değişken RNA stabilitesini indükleyebilir. Tarif edilen yöntemler, başka bir yerde tarif edilen klonlama işleminde küçük değişikliklerle STARR-seq veya konvansiyonel yönelime kolayca uyarlanabilir27,29.
Bu tekniği deneysel hedeflere uyacak şekilde daha da özelleştirmek için farklı AAV dağıtım yöntemleri kullanılabilir (Şekil 2B). Bu protokolde daha ayrıntılı olarak açıklanan doğrudan kafa içi enjeksiyonlar, doğrudan beyne yüksek konsantrasyonda virüs verir30. Bu, enjeksiyon bölgesinde merkezlenmiş yüksek bir transdüksiyon verimliliği sağlar, bu da bunu, bir doku alanı üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak isteyen deneyler için mükemmel bir teknik haline getirir. Stereotaktik enjeksiyon, tekrarlanabilir lokalize transdüksiyon için hayvanlar arasında enjeksiyon bölgesini standartlaştırmaya yardımcı olabilir. İntrakraniyal enjeksiyonlar erken postnatal hayvanlarda en basittir. Alternatif bir teknik olarak, sistemik enjeksiyonlar, kan-beyin bariyerini geçebilen serotiplere sahip AAV'leri kullanarak transgenler verebilir31. Kuyruk damarı enjeksiyonları, virüsün vücutta dolaşmasına izin vererek birçok dokuda genelleştirilmiş doğum sağlar10. Retro-orbital enjeksiyonlar, gözün arkasındaki virüsü retro-orbital sinüs32'ye ileten başka bir sistemik enjeksiyon tekniğidir. Bu, AAV için venöz sistemden beyne daha doğrudan bir yol sunar ve beyinde daha periferik kan damarlarına yapılan enjeksiyonlardan daha yüksek bir transdüke hücresi konsantrasyonu ile sonuçlanır33.
Bu tekniğin bir başka esnek yönü de okuma yöntemidir. Genel olarak, seçenekler muhabir tabanlı veya sıralama tabanlı olarak tanımlanabilir (Şekil 2C). GFP gibi bir floresan muhabirini yapının açık okuma çerçevesine dahil etmek, aday arttırıcının ifadeyi sürdüğü herhangi bir dönüştürülmüş hücrede floresan proteininin ekspresyonuyla sonuçlanır. İmmünohistokimya gibi etiketleme ve görüntüleme teknikleri sinyal amplifikasyonunu mümkün kılar. Dizileme tabanlı okuma teknikleri, dokudan toplanan RNA'da verilen yapıdan dizileri tanımlamayı içerir. Başlangıçta teslim edilen viral DNA miktarını ölçerek, eksprese edilen RNA ile verilen DNA'nın karşılaştırılması, test edilmiş bir arttırıcı dizisinin, örneğin kitlesel olarak paralel bir muhabir testi (MPRA) bağlamında, transgenin artan ekspresyonunu ne derece yönlendirebildiğini belirlemek için kullanılabilir. MPRA'lar, aynı anda aktivite için binlerce aday arttırıcıyı test etmek için bu tekniklerin güçlü bir genişlemesini sunar ve genomik araştırmalarda 12,27,34,35,36 kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Aday arttırıcılar için klonlama, paketleme, teslimat ve sıralama adımlarının tek tek değil, toplu olarak gerçekleştirilmesiyle daha yüksek verim taraması elde edilir.
Aday geliştirici seçimi, esneklik için başka bir fırsat sağlar (Şekil 2D). Örneğin, bu tahlil, belirli bir genin arttırıcılarını tanımlamak, ilgilenilen kodlamayan DNA bölgelerinin işlevini belirlemek veya bir arttırıcının aktif olduğu spesifik hücre tiplerini veya gelişim aşamalarını belirlemek için kullanılabilir - bunların hepsi hem temel bilimde hem de hastalık araştırmalarında hedeflere hizmet eder. Genel olarak, aday arttırıcı seçimi, arttırıcı aktivitenin in silico tahminleri tarafından yönlendirilir. Yaygın olarak, in silico tahminleri, H3K27ac37 ve kromatin erişilebilirlik haritalaması38 gibi olası arttırıcıları gösteren histon modifikasyonları için ChIP-seq'i içerir. Son olarak, büyüyen bir araştırma alanı, sentetik olarak tasarlanmış arttırıcı elemanların fonksiyon tabanlı taranmasıdır, bu da arttırıcı dizinin fonksiyon39'u nasıl yönlendirdiğine ve belirli özelliklere sahip arttırıcıların tasarımına dair çalışmalara olanak tanır40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Citrate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9999-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatcactctcggcatggac-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-gatggctggcaactagaagg-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A: Custom designed</td>
			<td>Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN605-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>for mouth-driven delivery of rAAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgY anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td>The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9806558</td>
			<td>These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AlexaFlour-488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom tubes 14 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>F0099-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine detail paint brush set</td>
			<td>Artbrush Tower</td>
			<td>B014GWCLFO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>5-000-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12663</td>
			<td>Commercial plasmid maxi prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV butterfly infusion set with 12&#34; tubing and 25G needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Lint-free wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar pre-mix for selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Vannas iris scissor</td>
			<td>Integra LifeSciences</td>
			<td>360-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>69794-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Stable Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.5</td>
			<td>Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sunny Select</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: AscI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme: XmaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0920S</td>
			<td>Recovery medium after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (RNase/DNase free)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>033522.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1179941</td>
			<td>For peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1460</td>
			<td>Plasmid mini prep kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aav deployment of enhancer-based expression constructs in vivo in mouse brain

Arttırıcılar, doku ve hücre tipine özgü genlerin spesifik ekspresyon modellerini yönlendiren çeşitli transkripsiyon faktörleri dizisi için bağlayıcı platformlardır. Kodlamayan DNA'yı ve çeşitli kromatin durumlarını değerlendirmenin birçok yolunun, genomdaki arttırıcı dizilerin varlığını tahmin etmede yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ancak bu dizilerin aktivitesini doğrulamak ve aktif oldukları organları ve gelişim aşamalarını bulmak emek yoğun bir süreçtir. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerindeki son gelişmeler, transgenlerin fare dokularına yaygın olarak verilmesini sağlamış ve transgenik bir hayvana ihtiyaç duymadan in vivo arttırıcı testi mümkün kılmıştır. Bu protokol, EGFP'yi minimal bir promotörün kontrolü altında ifade eden, kendi başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen bir muhabir yapısının, fare beynindeki aday geliştirici dizilerinin aktivite kalıplarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. AAV paketlenmiş bir muhabir yapısı fare beynine teslim edilir ve 1-4 hafta boyunca inkübe edilir, daha sonra hayvan kurban edilir ve beyin bölümleri mikroskop altında gözlemlenir. EGFP, test edilen arttırıcının gen ekspresyonunu başlatmak için yeterli olduğu hücrelerde ortaya çıkar ve arttırıcının beyinde aktif olduğu yeri ve gelişim aşamasını belirler. Standart klonlama yöntemleri, düşük maliyetli AAV paketlemesi ve genişleyen AAV serotipleri ve in vivo dağıtım yöntemleri ve standart görüntüleme okuması, bunu gen ekspresyonunun beyinde nasıl düzenlendiğinin incelenmesi için erişilebilir bir yaklaşım haline getirmektedir.

Bu yöntemler kullanılarak, CACNA1C 19,49,50 geninin psikiyatrik riskle ilişkili üçüncü intronunda 915 bp dizisi, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı aktivite açısından test edildi. Bu sekans, psikiyatrik ve nörolojik risk SNP'leri12'ye odaklanan 345 aday arttırıcı sekanstan oluşan bir MPRA'da keşfedilmiştir ve karakterizasyon deneyleri burada genel bir örnek olarak açık...

Watch this Scientific Journal Video about AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain at JoVE.com

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Bu protokol, yeni bir rAAV tabanlı geçici arttırıcı-muhabir analizini açıklamaktadır. Bu tahlil, fare beyninde in vivo olarak arttırıcı güdümlü ifadeyi indüklemek için kullanılabilir.

Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Bu protokol önemlidir, çünkü yalnızca bir geliştirici dizisinin ifadeyi yönlendirip yönlendiremeyeceğinin değil, aynı zamanda vücudun belirli bir bölümündeki ifadeyi nereye yönlendirebileceğinin görselleştirilmesini sağlar. Hızlı. Enjeksiyonların tamamlanması 10 dakikadan az sürer ve bir muhabir geninin ifade edilip edilmediği ve nerede ifade edildiği, numune toplandıktan sonraki birkaç gün içinde görülebilir.Klonlamaya başlamak için bir reporter yapısı seçin veya tasarlayın. Burada kullanılan yapı, geliştirici adayı, hsp68 minimal promotörünün kontrolü altında ifade edilen bir EGFP muhabir geninin çevrilmemiş üç ana bölgesine yerleştirir. Bir dizi ilgi alanını yükseltmek ve vektöre klonlamak için PCR primerlerini tasarlamak için, Gibson klonlaması için uygun homoloji kolunu primerlerin beş ana ucuna ekleyin.Tasarlanan primerleri kullanarak, bir DNA örneğinden PCR gerçekleştirin. Gerekli klonlama reaksiyonlarının istenen sayısına bağlı olarak Pac1 ve Asc1 kullanarak bir ila 10 mikrogram vektör DNA'sını sindirin. 100 voltta 30 ila 60 dakika boyunca% 0.7 ila% 1 jel elektroforezi kullanarak, kısıtlama sindirim parçalarını ayırın.Doğrusallaştırılmış vektör için bandı çıkarın ve ticari bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın. Gibson klonlaması ve hücrelerin dönüşümü tamamlandıktan sonra, hücreleri seçici ortamlara yerleştirir ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir. Muhabir yapısının başarılı klonlamasını doğruladıktan sonra, gliserol stoğunu kullanarak başlangıç kültürünün beş mililitresini aşılayın.Kültürü, sallanan bir inkübatörde 30 santigrat derecede ve dakikada 180 rotasyonda sekiz ila 16 saat boyunca büyütün. Et suyu bulanıklaştıkça, başlangıç kültürünü 250 ila 300 mililitre taze seçici LB suyunda 1.000x seyreltin ve gece boyunca 30 santigrat derecede sallanan bir inkübatörde ve dakikada 180 rotasyonda inkübe edin. Ticari bir plazmid maxi kiti kullanarak, plazmidi saflaştırın.ITR'lerin rekombinasyonunu test etmek için, bir Xma1 sindirimi gerçekleştirin. Bantları görselleştirin. Özetinizin beklenen bant sayısını gösterdiğinden emin olun.Rekombinasyon, beklenenden daha az bantla sonuçlanacaktır. Teslimat için rekombinant AAV karışımı hazırlayın. Birden fazla geliştirici muhabir virüsünün ifade kalıplarını karşılaştırıyorsanız, virüs titrelerini en az konsantre virüse eşitlemek için her virüsü seyreltin.Geliştirici muhabir virüsünü ve yapısal olarak ifade edilen kontrol muhabiri virüsünü iki ila bir veya üçe bir oranında karıştırın. Son konsantrasyonu %0,06 olan az miktarda hızlı yeşil boya ekleyinMikrolitre dereceli kılcal borudan yapılmış çekilmiş bir cam pipetin ucunu nazikçe delerek hassas, tüy bırakmayan bir mendil haline getirin. Pipetleri, mikrokapiler pipeti tutmak için lastik contaya bağlı basınç uygulayan bir cihazla aspiratör tertibatına yerleştirin.Aspiratörden negatif basınç uygulayarak pipete yaklaşık 0,2 ila 0,5 mikrolitre mineral yağ gibi küçük bir hacim çekin. Aspiratör tertibatını bir kenara koyun ve enjekte edilmeye hazır olana kadar virüsü buzun üzerine yerleştirin. Yenidoğan farelerini kriyo-anestezi uyguladıktan sonra, aspiratör tertibatını kullanarak negatif basınç uygulayın ve menisküs iki mikrolitrelik kene işaretini geçene kadar virüs karışımını çekilen cam pipete çekin.Fareyi soğuk odadan uzaklaştırın ve tezgahın üstüne yerleştirin. İki taraflı enjeksiyon bölgelerini lambda ve bregma arasındaki ortaya, ayrıca sagital sütür ve her bir gözün ortasına yerleştirin. Alkollü bir mendil kullanarak onları sterilize edin.Çekilen cam pipeti kullanarak yenidoğan farelerinin kafatasını delin. İğne kafatasına girerken, aspiratör tertibatından pozitif bir basınç uygulayın. Virüsün bir mikrolitresini lateral ventriküle dağıtın ve pipeti çekin.Kurtarmak için fareyi bir ısıtma yastığına veya bir ısıtma odasına yerleştirin. Uyandıktan sonra hayvanı ev kafesine geri döndürün. Düşük büyütmeli 5x öznel lens kullanarak beyin bölümünü geçen floresan görüntüleri kaydedin.Enjeksiyon bölgesini bularak, kırmızı floresan hücrelerin yoğunluğuna ve yoğunluğuna bağlı olarak virüs iletiminin derecesini değerlendirin. Benzer şekilde dönüştürülen hayvanları karşılaştırın. Floresan görüntüleri 25x'ten daha yüksek büyütmeli objektif lensle kaydedin.Ardından, analiz yazılımını açın ve gürültüyü azaltmak için üçe üç medyan filtre uygulayın. İşlem menüsüne tıklayın, ardından Gürültü'ye tıklayın ve Benek Gider seçeneğini seçin. Ardından, görüntülerden arka plan floresansını çıkarmak için, çok kanallı bir görüntünün kanallarını ayırarak başlayın.Görüntü menüsüne tıklayın, ardından Renk'e tıklayın ve Kanalları Böl seçeneğini seçin. Dikdörtgen veya daire seçim aracını kullanarak, herhangi bir floresan hücresi olmadan görüntünün bir alanına küçük bir şekil çizin. Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayarak arka planın ortalama piksel yoğunluğunu ölçün ve birden çok kez örneklemek için tekrarlayın.Ortalama gri değerin ortalamasını beş ila sekiz arka plan alanından alın ve ondalık değerleri bırakın. İşlem menüsünü seçerek görüntüdeki her pikselden değerleri çıkarın, ardından Matematik ve Çıkar'ı tıklayın. Ardından, çıkarılacak arka plan değerini girin ve Tamam'ı tıklatın. Gerekirse, Görüntü menüsünü seçerek kanalları tekrar çok kanallı bir görüntüde birleştirin, ardından Renk'e tıklayın ve Kanalları Birleştir'i seçin.Yeşil floresan hücrelerin sayısını saymak, yeşil kanalı gizlemek ve serbest form seçim aracını kullanarak beyin bölgesinin etrafına kırmızı floresanı ifade eden bir şekil çizin. Seçilen bölgedeki kırmızı kanalın alanını, entegre yoğunluğunu ve ortalama gri değerini ölçmek için Ölçüm işlevine tıklayın. Çok noktalı bir seçim aracı kullanarak yeşil hücrelerin sayısını sayın ve yeşil hücrelerin sayısını kırmızı kanalın tümleşik yoğunluğuna göre normalleştirin.Güçlendirici muhabiri dönüştürdükten sonra, farenin pozitif bir AAV yapısı ile P0'a intrakraniyal olarak enjekte edildiğini, enjeksiyondan 28 gün sonra korteksin orta alt katmanlarında arttırıcı güdümlü EGFP ekspresyonu gösterdi. P0'da negatif bir kontrol yapısı ile enjekte edilen fare, enjeksiyondan 28 gün sonra herhangi bir EGFP ifadesi göstermez, bu da arttırıcı elemanların fare beyninde EGFP'nin transkripsiyonunu yönlendirdiğini gösterir. Başarılı bir şekilde dönüştürülen alanı görselleştirmek ve potansiyel değişkenliği kontrol etmek için, farklı titrelerin AAV tarafından verilen geliştirici muhabir kütüphaneleri incelenmiştir.Aday arttırıcıların yüksek titre kütüphanesi geniş EGFP ekspresyonunu yönlendirirken, aday arttırıcıların düşük titre kütüphanesi P7 fare beyninde seyrek CGFP ekspresyonunu yönlendirir. Arttırıcı muhabir AAV'yi her enjeksiyonda pozitif kontrol ile karıştırmak, aktivitesi olmayan arttırıcılar ile başarısız teslimatlar arasında ayrım yapmak için hayati önem taşır. Bu prosedür, bir arttırıcının hangi hücre tiplerinde aktif olduğunu belirlemek için immünohistokimya, RNA FISH veya tek hücreli RNA dizilimi ile eşleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation (Video) | JoVE

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...