Name: spatial profiling of protein and rna expression in tissue: an approach to fine-tune virtual microdissection
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection at JoVE.com

Forfatterne anerkender Thomas Wu for behandling af NGS-filer. Vi takker James Ziai for resultaterne, diskussionerne og manuskriptgennemgangen og Meredith Triplet og Rachel Taylor for intern manuskriptrevision.

Alt humant væv blev erhvervet fra kommercielle biobanker eller akkrediterede vævsbanker under garanti for, at der blev opnået passende godkendelse fra Institutional Review Board og informeret samtykke.
BEMÆRK: Protokollen udføres ved hjælp af Discovery Ultra og GeoMx Digital Spatial Profiler. Se materialefortegnelsen for detaljer om reagenser, udstyr og software, der anvendes i denne protokol.
1. Automatiseret visualiseringsprotokol til ...

<ol>
	<li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy:+The+potential+and+promise.">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572 (2020).</li><li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+pathology:+a+user's+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue.">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization.">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).</li><li>. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: <a target="_blank" href="https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview">https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview</a> (2022)</li><li>. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022)</li><li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer:+a+user's+perspective.">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li><li>McNamara, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+proteomic+characterization+of+HER2-positive+breast+tumors+through+neoadjuvant+therapy+predicts+response.">Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response.</a> Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).</li><li>Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+pathologists:+Protocols,+pitfalls,+and+tips.">Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Mu&#241;oz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecularly+targeted+photothermal+ablation+improves+tumor+specificity+and+immune+modulation+in+a+rat+model+of+hepatocellular+carcinoma.">Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma.</a> Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).</li><li>Coleman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronidase+impairs+neutrophil+function+and+promotes+Group+B+Streptococcus+invasion+and+preterm+labor+in+nonhuman+primates.">Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates.</a> mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).</li><li>Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantitative+assessment+of+PD-L1+using+digital+spatial+profiling.">Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).</li><li>Carter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+spatially+defined+immune+(micro)landscapes+of+early-stage+PD-L1-positive+triple-negative+breast+cancer.">Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).</li><li>Busse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprofiling+in+neuroendocrine+neoplasms+unveil+immunosuppressive+microenvironment.">Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment.</a> Cancers. 12 (11), 3448 (2020).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+lung+SARS-CoV-2+and+influenza+virus+infection+dissects+virus-specific+host+responses+and+gene+signatures.">Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures.</a> European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).</li><li>Li, X., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+bulk,+single-cell+to+spatial+RNA+sequencing.">From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing.</a> International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf</a> (2020)</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+and+spatial+transcriptomics+of+archival+pancreatic+cancer+reveals+multi-compartment+reprogramming+after+neoadjuvant+treatment.">Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Jerby-Arnon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+immune+and+genetic+mechanisms+shape+oncogenic+programs+in+synovial+sarcoma.">Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma.</a> Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).</li></ol>

Til dato anvendes direkte konjugerede fluorescerende antistoffer i en manuel protokol mest som visualiseringspaneler til rumlig proteomics eller spatial transcriptomics assays 9,10. Brugen af direkte konjugerede fluorescerende antistoffer kan dog være udfordrende for mindre rigelige markører, hvilket begrænser udvælgelsen af egnede antistoffer. Denne protokol viser, at mærkning af visualiseringsmarkører kan automatiseres på en automatiseret farvningsplatfo...

Fremskridt inden for multiplexingteknikker fortsætter med at give bedre karakteriseringsværktøjer til mål, der er til stede i tumorer. Tumormikromiljøet (TME) er et komplekst system af tumorceller, infiltrerende immunceller og stroma, hvor rumlig information er afgørende for bedre at forstå og fortolke mekanismer for interaktion mellem biomarkører af interesse1. Med nye teknikker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) og 10x Visium kan flere mål detekteres og kvantificeres samtidigt inden for deres rumlige kontekst. Brugen af immunfluorescensprotokoller, der letter vævsvisualisering, kan yderligere forbedre disse teknologiers rumlige profileringskapacitet.
Den Spatial Omics-teknologi, vi fokuserede på til denne metodeudvikling, består af rumlig proteomics og transcriptomics assays, hvor oligonukleotider er bundet til antistoffer eller RNA-sonder via en UV-følsom fotospaltbar linker. Histologiske dias mærkes med disse oligo-konjugerede antistoffer eller sonder og afbildes derefter på den rumlige profileringsplatform. Dernæst vælges ROI'er i forskellige størrelser og former til belysning, og de fotospaltede oligonukleotider aspireres og opsamles i en 96-brøndplade. De fotospaltede oligonukleotider fremstilles til kvantificering med enten Nanostring nCounter-systemet eller Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (figur 1)4,5.
Cellefordelinger varierer inden for væv, og evnen til at karakterisere specifikke placeringer af celler ved hjælp af udvalgte markører og forskellige ROI-størrelser er af stor betydning for fuldt ud at forstå vævsmiljøet og identificere specifikke træk. I den her nævnte Spatial Omics-teknologi bruger standardvisualiseringsprotokollen direkte konjugerede antistoffer og er en manuel protokol. Standardmarkørerne til at skelne mellem tumor og stroma er panCytokeratin (panCK) og CD456,7, men yderligere markører er nødvendige for at målrette mod specifikke cellepopulationer af interesse. Desuden mangler brugen af direkte konjugerede fluorescerende antistoffer amplifikation, hvilket begrænser antistofudvælgelsen til rigelige markører. Derudover er manuelle analyser underlagt større variabilitet end automatiserede arbejdsgange8. Derfor er det ønskeligt at have en tilpasselig, automatiseret og forstærket visualiseringsprotokol til ROI-valg.
Her viser undersøgelsen, at TSA-teknologi til rumlige proteomics-assays kan bruges til visualiseringsprotokoller på en automatiseret platform, hvilket resulterer i et mere målrettet og standardiseret assay. Derudover muliggør TSA-baserede assays brugen af markører med lavt udtryk, hvilket øger rækkevidden af mål, der kan vælges til visualisering. Et 3-plex assay for panCK, FAP og Antibody X blev udviklet ved hjælp af en automatiseret platform, hvor panCK og FAP blev brugt til at skelne mellem henholdsvis tumor og stroma. Antistof X er et stromalt protein, der ofte forekommer i tumorer, men dets biologi og indvirkning på antitumorimmunitet forstås ikke fuldt ud. Karakterisering af immunkonteksten i områder, der er rige på antistof X, kan belyse dets rolle i antitumorimmunitet og terapeutisk respons samt dets potentiale som lægemiddelmål.
Mens tilpassede automatiserede TSA-visualiseringspaneler viste sig at være vellykkede for rumlige proteomics-assays, kunne anvendelsen af disse assays til rumlige transkriptomics-assays ikke bekræftes. Dette skyldes sandsynligvis reagenserne og protokollen, der anvendes til de automatiserede visualiseringsprotokoller, som synes at kompromittere RNA-integriteten. At erkende, at en automatiseret mærkningsprotokol til visualiseringsmarkører kan bruges til rumlige proteomics-assays, men ikke til rumlige transkriptomics-assays, giver vigtig vejledning om Spatial Omics-teknologianalysedesign.
Derudover viser undersøgelsen, at det rumlige transkriptomiske assay kan bruges til at profilere mål i regioner så små som 50 μm i diameter eller ca. 15 celler. To ROI'er i forskellige størrelser blev udvalgt for at teste analysens evne til også at detektere transkripter i små ROI'er. For hver region af interesse blev oligoer svarende til 1.800 mRNA-mål indsamlet og lavet til biblioteker i henhold til den rumlige profileringsplatformsprotokol. Biblioteker blev individuelt indekseret, efterfølgende samlet og sekventeret. Dette gjorde det muligt at evaluere både poolingeffektivitet og evnen til at identificere specifikke cellepopulationer i små ROI'er.
Dette papir viser, at for rumlige proteomics-assays kan en automatiseret protokol til vejledning af ROI-udvælgelse på specifikke markører af interesse bruges til selektivt at målrette forhør af relevante vævsområder og karakterisere vævets rumlige miljø. Desuden demonstrerer vi, at mindre ROI'er kan bruges til rumlige transkriptomiske assays til at detektere og karakterisere specifikke cellepopulationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris buffered saline (TBS)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Diluted to 1x TBS in DEPC treated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody X (not disclosed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antibody blinded due to confidentiality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9922</td>
			<td>Another can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>950-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY Cy5 Kit</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>760-238</td>
			<td>Referred as Cy5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY FAM Kit</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>760-243</td>
			<td>Referred as FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY Goat Ig Block</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>760-6008</td>
			<td>Referred as Gt Ig Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>760-4310</td>
			<td>Referred as OMap anti-Ms HRP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>760-4311</td>
			<td>Referred as OMap anti-Rb HRP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY Rhodamine 6G Kit</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>760-244</td>
			<td>Referred as Rhodamine 6G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td>
			<td>Referred as autostainer on the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAP [EPR20021] Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab207178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler</td>
			<td>NanoString</td>
			<td>GMX-DSP-1Y</td>
			<td>Referred as spatial profiling platform on the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td>Another can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab27988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>950-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism 7</td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 64</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>950-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Antibody Diluent with Casein</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>760-219</td>
			<td>Referred as specified diluent on the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Primary antibody dispenser</td>
			<td>Ventana</td>
			<td></td>
			<td>Catalog number depends on dispenser number</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial profiling of protein and rna expression in tissue: an approach to fine-tune virtual microdissection

Multiplexing muliggør vurdering af flere markører på det samme væv, samtidig med at der gives rumlig kontekst. Rumlige Omics-teknologier tillader både protein- og RNA-multiplexing ved at udnytte henholdsvis fotospaltbare oligo-mærkede antistoffer og sonder. Oligos spaltes og kvantificeres fra bestemte regioner på tværs af vævet for at belyse den underliggende biologi. Her viser undersøgelsen, at automatiserede brugerdefinerede antistofvisualiseringsprotokoller kan bruges til at guide ROI-valg i forbindelse med rumlige proteomics-assays. Denne specifikke metode viste ikke acceptabel ydeevne med rumlige transkriptomiske assays. Protokollen beskriver udviklingen af et 3-plex immunofluorescerende (IF) assay til markørvisualisering på en automatiseret platform ved hjælp af tyramidsignalforstærkning (TSA) til at forstærke fluorescerende signal fra et givet proteinmål og øge antistofpuljen at vælge imellem. Visualiseringsprotokollen blev automatiseret ved hjælp af et grundigt valideret 3-plex-assay for at sikre kvalitet og reproducerbarhed. Derudover blev udvekslingen af DAPI for SYTO-farvestoffer evalueret for at muliggøre billeddannelse af TSA-baserede IF-assays på den rumlige profileringsplatform. Derudover testede vi evnen til at vælge små ROI'er ved hjælp af det rumlige transkriptomiske assay for at muliggøre undersøgelse af meget specifikke interesseområder (f.eks. Områder beriget til en given celletype). ROI'er på 50 μm og 300 μm diameter blev indsamlet, hvilket svarer til henholdsvis ca. 15 celler og 100 celler. Prøver blev lavet i biblioteker og sekventeret for at undersøge evnen til at detektere signaler fra små ROI'er og profilspecifikke områder af vævet. Vi fastslog, at rumlige proteomics-teknologier i høj grad drager fordel af automatiserede, standardiserede protokoller til at guide ROI-valg. Selvom denne automatiserede visualiseringsprotokol ikke var kompatibel med rumlige transkriptomiske assays, var vi i stand til at teste og bekræfte, at specifikke cellepopulationer med succes kan detekteres selv i små ROI'er med standard manuel visualiseringsprotokol.

Automatiseret visualiseringsprotokol til vejledning af ROI-valg I dette papir præsenterer vi brugen af en automatiseret, brugerdefineret TSA-baseret IF-protokol til at visualisere vævet og vælge specifikke ROI'er. Udvikling af visualiseringspanel ved hjælp af melanom og normal hud som kontrolvæv bestod af epitopstabilitetstest, finjustering af markørintensiteter og gennemblødningsvurdering gennem udeladelseskontrol. For at teste, om antistoffernes epitopstabilitet påvirkes af gentagne eluering...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection at JoVE.com

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection (Video) | JoVE

Her beskriver vi en protokol til finjustering af interesseområder (ROI'er) for rumlige omikteknologier for bedre at karakterisere tumormikromiljøet og identificere specifikke cellepopulationer. For proteomics-assays kan automatiserede tilpassede protokoller guide ROI-valg, mens transkriptomics-assays kan finjusteres ved hjælp af ROI'er så små som 50 μm.

Rumlig profilering af protein- og RNA-ekspression i væv: En tilgang til finjustering af virtuel mikrodissektion

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Denne protokol hjælper med at guide udvælgelsen af regioner af interesse for rumlige omics-teknologier, hvilket muliggør en mere målrettet karakterisering af væv eller cellepopulationer. En automatiseret protokol til ROI-selektion i proteomics-assays er mere robust og reproducerbar end manuelle protokoller, og brug af 50 mikrometer ROI'er til transkriptomics-assays muliggør profilering af specifikke cellepopulationer. Start med at programmere autostaineren til at anvende fluorescerende visualiseringsantistoffer.I autostainer-softwaren skal du klikke på startknappen og vælge Protokoller. Klik derefter på Opret / rediger protokoller, og vælg RUO Discovery Universal som procedure. Klik på Første sekvens, vælg derefter Deparaffinazation efterfulgt af Depar v2.For Medium temperatur skal du vælge 72 grader Celsius, derefter klikke på Forbehandling og vælge Cellekonditionering og CC1-reservoir. For Meget høj temperatur skal du vælge 100 grader Celsius, derefter klikke på CC1 otte minutter og fortsætte med at klikke, indtil CC1 64 minutter er valgt. Klik på Inhibitor, vælg derefter DISCOVERY Inhibitor, og vælg otte minutter for Inkubationstid.Klik derefter på Antistof, efterfulgt af High-Temp Antistof Inkubation. For lav temperatur skal du vælge 37 grader Celsius. For antistof skal du vælge ANTISTOF 6 fra dispenseretiketten.For Plus inkubationstid skal du vælge 32 minutter. Klik på Multimer HRP, og vælg derefter Multimer HRP Blocker. Vælg derefter for antistofblokering Gt Ig-blok.Og for inkubationstid skal du vælge fire minutter. Vælg derefter OMap Anti-Rb HRP på Multimer HRP Reagens, og vælg 16 minutter for Inkubationstid. Klik derefter på Cy5, og for lang inkubationstid skal du vælge nul time, otte minutter.Klik på Dual Sequence og vælg Antistof Denaturering. Vælg derefter Antistof Denature CC2-1, og vælg 100 grader Celsius for en meget høj temperatur. Sørg for, at inkubationstiden er otte minutter.Klik derefter på DS Inhibitor og vælg Neutraliser. Klik på DS-antistof, og vælg 37 grader Celsius for meget lav temperatur. Vælg derefter ANTISTOF 3 fra dispenseretiketten i Antistof.Og for Plus Incubation Time skal du vælge 32 minutter. Klik på DS Multimer HRP, og vælg DS Multimer HRP Blocker. Vælg derefter Gt Ig-blok for antistofblokering, og vælg fire minutter for inkubationstid.Vælg derefter OMap anti-MS HRP på Multimer HRP Reagens, og vælg 16 minutter for Inkubationstid. Klik derefter på DS Rhodamin 6G, og vælg nul time, otte minutter for lang inkubationstid. Klik på Triple Stain og vælg TS Antistof Denaturering, vælg derefter Antistof Denature CC2-2, og for Meget høj temperatur, vælg 100 grader Celsius.Sørg for, at inkubationstiden er otte minutter. Klik derefter på TS-hæmmer og vælg TS Neutraliser. Klik på TS-antistof, og vælg 37 grader Celsius for meget lav temperatur.Vælg derefter ANTISTOF 7 fra dispenseretiketten i Antistof, og vælg 32 minutter for Plus inkubationstid. Klik på TS Multimer HRP og vælg TS Multimer HRP Blocker. Vælg derefter Gt Ig-blok for antistofblokering, og vælg fire minutter for inkubationstid.Vælg derefter OMap Anti-Rb HRP på Multimer HRP Reagens, og vælg 16 minutter for Inkubationstid. Klik derefter på TS FAM, og vælg nul time, otte minutter for lang inkubationstid. Klik på Gem og tilføj en titel til protokollen.Vælg et protokolnummer, tilføj en kommentar, og klik på Aktiv efterfulgt af Gem. Bag leverandørindkøbte formalinfikserede paraffinindlejrede humane vævssektioner i en ovn indstillet til 70 grader Celsius i 20 til 60 minutter. Mens dias bager, kan du udskrive etiketter ved at klikke på Opret etiket i autostainer-softwaren.Klik derefter på Protokoller, vælg protokolnummeret og klik på Luk / Udskriv. Tilføj relevante oplysninger på diasetiketten, og klik på Udskriv. Fjern gliderne fra ovnen og lad dem køle af til stuetemperatur.Anvend de tidligere udskrevne protokoletiketter på de tilsvarende dias. Fyld genopfyldelige antistofdispensere med antistoffer i henhold til antistofmærkningsnumrene. Hvert antistof fortyndes i det specificerede fortyndingsmiddel, og de genopfyldelige antistofdispensere klargøres.Saml blokerende, detekterings- og forstærkningsfyldte reagensdispensere, og anbring dem på instrumentreagensbakken. Indlæs dias i diasskufferne, og klik på Kører efterfulgt af Ja. Bekræft starten af kørslen ved at kontrollere kørselsvarigheden på autostainer-softwaren.Den næste dag skal du sikre færdiggørelsen af kørslen ved at observere grønne blinkende lys på diasskuffeåbningerne. Tag derefter gliderne af instrumentet, og skyl objektglassene kraftigt i 1x reaktionsbuffer, indtil væskedækslets glideopløsning er helt fjernet. Udskift SYTO 13 med SYTO 64 ved 5.000 nanomolær for at muliggøre fluoroforintegration.Fortynd SYTO 64 i 1x TBS og inkuber i et fugtighedskammer i 15 minutter. Brug FITC til DISCOVERY Fam, og indstil eksponeringen til 200 millisekunder. Brug Cy3 til DISCOVERY Rhodamin 6G og indstil eksponeringen til 200 millisekunder.Brug Texas Red til SYTO 64, og indstil eksponeringen til 50 millisekunder. Angiv SYTO 64 som fokuskanal, og brug til sidst Cy5 til DISCOVERY Cy5. Indstil eksponeringen til 200 millisekunder, og gem ændringer.Bag formalinfikserede paraffinindlejrede cellepillesektioner i en ovn indstillet til 70 grader Celsius i 20 til 60 minutter. Scan dias på den rumlige profileringsplatform, og vælg størrelser på 50 mikrometer og 300 mikrometer. Den automatiserede visualiseringsprotokol blev udviklet ved at inkludere leave one out-kontroller for at bekræfte, at der ikke var nogen gennemblødning fra nabokanalerne.Log 2-varmekortet over alle markørerne inkluderet i det rumlige proteomics-assay, der sammenligner den manuelle pan-cytokeratin CD 45-protokol i sort med den automatiserede 3-plex-protokol i grå, viser en Spearman R-værdi på 0,88. Af de 31 antistoffer, der blev anvendt i analyserne, havde 23 antistoffer en Spearman R-værdi, der var højere end eller lig med 0,5. Log 2-varmekortet over udvalgte mål, der er inkluderet i det rumlige transkriptomiske assay, der sammenligner den manuelle pan-cytokeratin CD 45-protokol i sort med den 3-plex automatiserede protokol i grå, viste forskelle i disse værdier.Sekventeringsdataene for 3-plex automatiseret visualiseringsprotokol præsenterede lavere værdier sammenlignet med pan-cytokeratin CD 45 manuel visualiseringsprotokol, hvilket også afspejles af de lave Spearman R-værdier på 0,15. Der blev også observeret et tab af dynamisk område ved brug af den automatiserede protokol med 3-plex visualisering. Påvisningen af små ROI'er i den rumlige transkriptomikprotokol blev udført ved udvælgelsen af cirkulære områder af interesse ved RNA-tællinger på 50 mikrometer og 300 mikrometer diameter for udvalgte mål på forskellige cellelinjer var sammenlignelige mellem de to regioner af interessestørrelser efter normalisering.Denne protokol til automatiserede visualiseringspaneler kan tilpasses af forskere ved at udveksle markører for at udvikle paneler, der præcist definerer ROI'er for at besvare deres rumlige proteomiske spørgsmål.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics (Video) | JoVE

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks (Video) | JoVE

Bestemmelse af Protein udtryk niveau i kulturperler celler ved immuncytokemi på Paraffin-embedded celle blokke

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells (Video) | JoVE

Rumlig og tidsmæssig kontrol af murine melanom initiering fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (Video) | JoVE

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines (Video) | JoVE

Cellulær profilering med høj kapacitet af målrettede proteinnedbrydningsforbindelser ved hjælp af HiBiT CRISPR-cellelinjer

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2 (Video) | JoVE

Tre metoder til differentialudtryksanalyse til RNA-sekventering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids (Video) | JoVE

Profilering af følsomhed over for målrettede terapier i EGFR-mutant NSCLC-patientafledte organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma (Video) | JoVE

Digital rumlig profilering til karakterisering af mikromiljøet i voksentype diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging (Video) | JoVE

Generering og billeddannelse af muse- og humane epitelorganoider fra normalt væv og tumorbrystvæv uden passage

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples (Video) | JoVE

Multiplexed stregkode billedanalyse til immunprofilering og rumlig kortlægning karakterisering i enkeltcelleanalyse af paraffinvævsprøver

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...