Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (n° 81571994 à P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.

1. Maintien des cellules souches
REMARQUE: Le protocole de maintenance cellulaire décrit ci-dessous s’applique à la lignée cellulaire hES03 maintenue dans une monocouche adhérente. Pour tous les protocoles suivants dans ce manuscrit, les cellules doivent être manipulées sous une armoire de sécurité biologique.
<ol><li>Préparer 1x mTesR de milieu de culture de cellules souches en diluant 5x milieu supplémentaire au milieu de base mTesR.</li>
	<li>Préparer 30x milieu Matrigel qual...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Ici, nous présentons une méthode par étapes qui induit des CHN à partir de CSEh en trois étapes. Dans la première étape, Activin A et CHIR99021 ont été utilisés pour différencier les CSEh en DE. Dans la deuxième étape, KO-DMEM et DMSO ont été utilisés pour différencier DE en cellules progénitrices hépatiques. Au cours de la troisième étape, le HZM plus HGF, l’OSM et le sel de sodium de l’hydrocortisone 21-hemisuccinate ont été utilisés pour continuer à différencier les cellules progénitrice...

Le foie est un organe hautement métabolique qui joue plusieurs rôles, notamment la désoxydation, le stockage du glycogène, la sécrétion et la synthèse des protéines1. Divers agents pathogènes, médicaments et hérédité peuvent provoquer des changements pathologiques dans le foie et affecter ses fonctions2,3. Les hépatocytes, en tant que principale unité fonctionnelle du foie, jouent un rôle important dans les systèmes artificiels de soutien du foie et l’élimination de la toxicité des médicaments. Cependant, la ressource en hépatocytes humains primaires est limitée dans la thérapie cellulaire, ainsi que dans la recherche sur les maladies du foie. Par conséquent, le développement de nouvelles sources d’hépatocytes humains fonctionnels est une direction de recherche importante dans le domaine de la médecine régénérative. Depuis 1998, date à laquelle les CSEh ont étéétablies, 4, les CSEh ont été largement prises en compte par les chercheurs en raison de leur potentiel de différenciation supérieur (ils peuvent se différencier en divers tissus dans un environnement approprié) et de leur haut degré d’autorenouvrabilité, et fournissent ainsi des cellules sources idéales pour les foies bioartificiels, la transplantation d’hépatocytes et même l’ingénierie tissulaire hépatique5.
Actuellement, l’efficacité de la différenciation hépatique peut être considérablement augmentée en enrichissant l’endoderme6. Dans la différenciation de la lignée des cellules souches en endoderme, les niveaux de la signalisation du facteur de croissance transformant β (TGF-β) et des voies de signalisation WNT sont les facteurs clés dans le nœud de l’étape de formation de l’endoderme. L’activation d’un haut niveau de signalisation TGF-β et WNT peut favoriser le développement de l’endoderme7,8. L’activine A est une cytokine appartenant à la superfamille TGF-β. Par conséquent, l’activine A est largement utilisée dans l’induction endodermique de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) et decsh 9,10. GSK3 est une protéine kinase sérine-thréonine. Les chercheurs ont constaté que CHIR99021, un inhibiteur spécifique de GSK3β, peut stimuler les signaux WNT typiques, et peut promouvoir la différenciation des cellules souches dans certaines conditions, ce qui suggère que CHIR99021 a le potentiel d’induire la différenciation des cellules souches dans l’endoderme 11,12,13.
Ici nous rapportons une méthode efficace et reproductible pour induire efficacement la différenciation des cseh en HLCs fonctionnels. L’addition séquentielle de l’Activine A et du CHIR99021 a produit environ 89,7±0,8 % de cellules SOX17 (marqueur DE) positives. Après avoir été encore maturées in vitro,ces cellules ont exprimé des marqueurs spécifiques hépatiques et exercé hépatocytes-comme la morphologie (basée sur la souillure d’hématoxyline-éosine (H &E)) et les fonctions, telles que l’absorption du vert d’indocyanine (ICG), le stockage de glycogène et l’activité CYP3. Les résultats montrent que les CSEh peuvent être différenciés avec succès en CSH fonctionnels matures par cette méthode et peuvent fournir une base pour la recherche liée aux maladies du foie et le dépistage in vitro des médicaments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

Les fonctions potentielles des cellules de type hépatocytes (CHN) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont très prometteuses pour les applications de modélisation des maladies et de dépistage des médicaments. Il est fourni ici une méthode efficace et reproductible pour différencier les CSEh en CSH fonctionnels. L’établissement d’une lignée endodermique est une étape clé dans la différenciation aux HLCs. Par notre méthode, nous régulons les voies de signalisation clés en complétant continuellement l’Activine A et le CHIR99021 lors de la différenciation hESC en endoderme définitif (DE), suivie de la génération de cellules progénitrices hépatiques, et enfin des CHN avec une morphologie hépatocytes typique dans une méthode par étapes avec des réactifs complètement définis. Les HNC dérivés du hESC produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques au stade (y compris l’albumine, le récepteur nucléaire HNF4α et le polypeptide de cotransport du taurocholate de sodium (NTCP)), et présentent des caractéristiques particulières liées aux hépatocytes matures et fonctionnels (y compris la coloration verte à l’indocyanine, le stockage du glycogène, la coloration à l’hématoxyline-éosine et l’activité CYP3), et peuvent fournir une plate-forme pour le développement d’applications à base de HLC dans l’étude des maladies du foie.

Le diagramme schématique de l’induction HLC à partir des CSEh et des images représentatives en champ lumineux de chaque étape de différenciation sont illustrés à la figure 1. Au stade I, l’activine A et le CHIR99021 ont été ajoutés pendant 3 jours pour inciter les cellules souches à former des cellules endodermiques. Au stade II, les cellules endodermiques se sont différenciées en cellules progénitrices hépatiques après avoir été traitées avec un milieu de différencia...

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An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Les cellules de type hépatocytes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines sont utiles dans la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Il s’agit d’une méthode efficace et reproductible pour induire efficacement la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines en cellules fonctionnelles ressemblant à des hépatocytes. Un statut indifférencié et une confluence appropriée de cellules souches embryonnaires humaines sont essentiels pour une différenciation réussie aux cellules de type hépatocytes.Pour l’entretien des cellules souches, enrobez les plaques stériles traitées par culture de tissus à six puits d’un millilitre de Matrigel qualifié en cellules souches embryonnaires humaines 1X par puits, et stockez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Laisser les plaques à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Décongeler les HESE cryo-conservés dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant trois minutes sans secouer, puis transférer immédiatement les cellules souches en les canalisant dans un tube à centrifuger de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu mTESR préchauffé de 37 degrés Celsius.Centrifuger les HESE et aspirer le surnageant, puis suspendre doucement les cellules dans un millilitre de milieu mTESR. Aspirer le milieu DMEM F-12 de la plaque. Ensemencer les cellules dans une plaque de six puits à une densité de 1 x 10 aux 5ème cellules dans deux millilitres de mTESR, et incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5%.Entretenir les cellules en remplaçant quotidiennement le milieu par un milieu mTESR préchauffé. Faites passer les cellules à environ 70 à 80% de confluence, ou lorsque les colonies cellulaires commencent à entrer en contact. Pour les cellules qui passent, aspirer le milieu et incuber les cellules avec un millilitre par puits de solution enzymatique pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Transférer les cellules en les pipetant dans un tube de centrifugation de 15 millilitres contenant quatre millilitres de DMEM F-12 préchauffés à 37 degrés Celsius. Préparez des plaques de 24 puits en les recouvrant de 250 microlitres de milieu Matrigel qualifié 1X hESC. Ensemencement de cseh à une densité de 1 à 1,5 fois 10 à 5ème cellules par puits dans 500 microlitres de milieu mTESR.Ajouter à la fois l’activine A à une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre et CHIR99021 à une concentration finale de trois micromolaires dans un volume approprié de milieu de base de différenciation préchauffé de stade un. Après trois jours de différenciation, les cellules différenciées devraient exprimer des marqueurs des cellules endodermiques définitives, telles que FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 et FOXA1. Le troisième jour de différenciation, aspirez le milieu, remplacez-le par le milieu de stade deux et incuber pendant 24 heures.Changez le support tous les deux jours les quatre à huit jours. Après huit jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs appropriés des cellules progénitrices hépatiques, telles que HNF4 alpha, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. Le huitième jour, aspirez le milieu de stade deux des cellules et remplacez-le par un milieu de stade trois.Laissez les cellules incuber pendant 10 jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone et changez le milieu tous les deux jours avec des facteurs de différenciation fraîchement ajoutés. Après 18 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs caractéristiques des hépatocytes, tels que AAT, ALB, TTR, HNF4 alpha, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Le diagramme schématique des cellules de type hépatocytes des CSEh et des images de champ lumineux de chaque étape de différenciation sont montrés.Au premier stade, l’activine A et le CHIR99021 ont été ajoutés pendant trois jours pour inciter les cellules souches à former des cellules endodermiques. Au stade deux, les cellules endodermiques se sont différenciées en cellules progénitrices hépatiques après avoir été traitées avec un milieu de différenciation pendant cinq jours. À l’étape trois, après 10 jours, les hepatocytes tôt avaient mûri et différencié en hépatocytes-comme des cellules dans le facteur de croissance d’hépatocytes et l’oncostatine.À la dernière étape de la différentiation, les cellules ont montré un phénotype typique de hepatocyte. RT-PCR, souillure d’immunofluorescence, et éponger occidental ont été utilisés pour détecter des marqueurs des cellules endodermiques, des cellules hépatiques de précurseur, et des hepatocytes mûrs. Les cellules différenciées ont montré des niveaux élevés d’expression des gènes et des protéines liés à la différenciation à chaque étape, tels que les marqueurs endodermiques SOX17 au troisième jour, le marqueur HNF4 alpha de précurseur hépatique au jour huit, l’AFP au jour 14, et le marqueur mature d’hépatocytes ALB au jour 18.Le HLCs a montré la souillure verte et la souillure étendue de décalage d’acide cytoplasmique. Les hepatocytes ont montré la morphologie bi-nucléée typique. L’activité enzymatique de CYP3A4, cyp métabolique essentiel dans le foie dans HLCs, a été confirmée avec une analyse d’enzymes.L’implantation des cellules souches embryonnaires humaines à une densité appropriée et le début de la différenciation à la date suivante sont essentiels. Dans la première étape, touchez doucement le support car les cellules sont sujettes à flotter vers le haut. La combinaison de l’activine A et d’autres petites molécules peut encore améliorer les efficacités de différenciation, et produire des cellules hepatocyte-comme plus mûres dans ce procédé.Cette technique peut fournir une plate-forme pour explorer la transplantation d’hépatocytes, l’ingénierie des tissus hépatiques, les foies bioartificiels et la modélisation des maladies.

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