Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 zu X.L.Z.), (Nr. 81571994 zu P.N.S.) unterstützt; die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Nr. 2020A1515010054 bis P.N.S.), Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für nützliche Ratschläge.

1. Stammzellpflege
HINWEIS: Das unten beschriebene Zellwartungsprotokoll gilt für die hES03-Zelllinie, die in einer adhärenten Monoschicht gepflegt wird. Für alle folgenden Protokolle in diesem Manuskript sollten Zellen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank behandelt werden.
<ol><li>Bereiten Sie 1x mTesR-Stammzellkulturmedium vor, indem Sie 5x Ergänzungsmedium auf mTesR-Basismedium verdünnen.</li>
	<li>Bereiten Sie 30x hESC-qualifiziertes Matrigelmedium vor, indem Sie 5 ml hESC-q...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Hier stellen wir eine schrittweise Methode vor, die HLCs aus hESCs in drei Stufen induziert. In der ersten Stufe wurden Activin A und CHIR99021 verwendet, um hESCs in DE zu unterscheiden. In der zweiten Stufe wurden KO-DMEM und DMSO verwendet, um DE in hepatische Vorläuferzellen zu differenzieren. In der dritten Stufe wurden HZM plus HGF, OSM und Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz verwendet, um die hepatischen Vorläuferzellen weiterhin in HLCs zu differenzieren.
Die folgenden kritisch...

Die Leber ist ein stark metabolisches Organ, das mehrere Rollen spielt, einschließlich Desoxidation, Speicherung von Glykogen und Sekretion und Synthese von Proteinen1. Verschiedene Krankheitserreger, Medikamente und Vererbung können pathologische Veränderungen in der Leber verursachen und ihre Funktionen beeinflussen2,3. Hepatozyten als Hauptfunktionseinheit der Leber spielen eine wichtige Rolle bei künstlichen Leberunterstützungssystemen und der Eliminierung der Arzneimitteltoxizität. Die Ressource primärer humaner Hepatozyten ist jedoch sowohl in der zellbasierten Therapie als auch in der Lebererkrankungsforschung begrenzt. Daher ist die Entwicklung neuer Quellen funktioneller menschlicher Hepatozyten eine wichtige Forschungsrichtung im Bereich der regenerativen Medizin. Seit 1998, als hESCs etabliert wurden4, wurden hESCs von Forschern wegen ihres überlegenen Differenzierungspotenzials (sie können sich in einer geeigneten Umgebung in verschiedene Gewebe differenzieren) und eines hohen Grades an Selbsterneuerbarkeit weithin in Betracht gezogen und bieten somit ideale Quellzellen für biokünstliche Lebern, Hepatozytentransplantation und sogar Lebergewebe-Engineering5.
Derzeit kann die hepatische Differenzierungseffizienz durch Anreicherung des Endoderms6stark erhöht werden. Bei der Liniendifferenzierung von Stammzellen in Endoderm sind ebenen des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) Signalwege und WNT-Signalwege die Schlüsselfaktoren im Knoten des Endodermbildungsstadiums. Die Aktivierung eines hohen TGF-β- und WNT-Signals kann die Entwicklung von Endoderm7,8fördern. Activin A ist ein Zytokin, das zur TGF-β-Superfamilie gehört. Daher wird Activin A häufig in der Endoderminduktion von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und hESCs9,10verwendet. GSK3 ist eine Serin-Threonin-Proteinkinase. Forscher haben herausgefunden, dass CHIR99021, ein spezifischer Inhibitor von GSK3β, typische WNT-Signale stimulieren und unter bestimmten Bedingungen die Stammzelldifferenzierung fördern kann, was darauf hindeutet, dass CHIR99021 das Potenzial hat, die Stammzelldifferenzierung in Endoderm 11,12,13zu induzieren.
Hier berichten wir über eine effiziente und reproduzierbare Methode, um die Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs effektiv zu induzieren. Die sequentielle Zugabe von Activin A und CHIR99021 erzeugte etwa 89,7±0,8% SOX17 (DE-Marker)-positive Zellen. Nach der weiteren Reifung in vitroexprimierten diese Zellen leberspezifische Marker und übten eine hepatozytenähnliche Morphologie (basierend auf Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H & E)) und Funktionen wie die Aufnahme von Indocyaningrün (ICG), Glykogenspeicherung und CYP3-Aktivität aus. Die Ergebnisse zeigen, dass hESCs mit dieser Methode erfolgreich in reife funktionelle HLCs differenziert werden können und eine Grundlage für leberkrankheitsbezogene Forschung und In-vitro-Wirkstoffscreening bieten können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

Die potenziellen Funktionen von Hepatozyten-ähnlichen Zellen (HLCs), die aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind vielversprechend für die Krankheitsmodellierung und Das Screening von Medikamenten. Hier steht eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs zur Verfügung. Die Etablierung einer Endoderm-Linie ist ein wichtiger Schritt bei der Differenzierung zu HLCs. Mit unserer Methode regulieren wir die wichtigsten Signalwege, indem wir Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung kontinuierlich in definitives Endoderm (DE) ergänzen, gefolgt von der Generierung von hepatischen Vorläuferzellen und schließlich HLCs mit typischer Hepatozytenmorphologie in einer stufenweisen Methode mit vollständig definierten Reagenzien. Die mit dieser Methode hergestellten hESC-abgeleiteten HLCs exprimieren stadiumsspezifische Marker (einschließlich Albumin, HNF4α-Kernrezeptor und Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid (NTCP)) und zeigen besondere Eigenschaften im Zusammenhang mit reifen und funktionellen Hepatozyten (einschließlich Indocyanin-Grünfärbung, Glykogenspeicherung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und CYP3-Aktivität) und können eine Plattform für die Entwicklung von HLC-basierten Anwendungen in der Untersuchung von Lebererkrankungen bieten.

Das schematische Diagramm der HLC-Induktion von hESCs und repräsentative Hellfeldbilder jeder Differenzierungsstufe sind in Abbildung 1 dargestellt. Im Stadium I wurden Activin A und CHIR99021 für 3 Tage hinzugefügt, um Stammzellen zur Bildung von Endodermzellen zu induzieren. Im Stadium II differenzierten sich die Endodermzellen nach 5-tägiger Behandlung mit Differenzierungsmedium zu leberförmigen Vorläuferzellen. Im Stadium III waren frühe Hepatozyten nach 10 Tagen in HGF und OSM ge...

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An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Humane embryonale Stammzellen-abgeleitete Hepatozyten-ähnliche Zellen sind nützlich bei der Krankheitsmodellierung und beim Drogenscreening. Dies ist eine effiziente und reproduzierbare Methode, um die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen effektiv zu induzieren. Ein undifferenzierter Status und ein angemessener Zusammenfluss menschlicher embryonaler Stammzellen sind entscheidend für eine erfolgreiche Differenzierung zu hepatozytenähnlichen Zellen.Für die Stammzellpflege sterile Sechs-Well-Gewebekultur-behandelte Platten mit einem Milliliter 1X humanem embryonalem Stammzell-qualifiziertem Matrigel pro Vertiefung beschichten und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Lassen Sie die Platten vor Gebrauch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die kryokonservierten HESEs in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad drei Minuten ohne Schütteln auftauen und dann die Stammzellen sofort durch Pipettieren in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit vier Millilitern vorgewärmtem, 37 Grad Celsius mTESR-Medium übertragen.Zentrifugieren Sie die HESEs und saugen Sie den Überstand an, dann suspendieren Sie die Zellen vorsichtig in einem Milliliter mTESR-Medium. Saugen Sie das DMEM F-12 Medium von der Platte ab. Säen Sie die Zellen in eine Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x 10 bis zur 5. Zellen in zwei Milliliter mTESR und inkubieren Sie sie in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.Pflegen Sie die Zellen, indem Sie das Medium täglich durch vorgewärmtes mTESR-Medium ersetzen. Passage der Zellen bei etwa 70 bis 80% Konfluenz oder wenn die Zellkolonien beginnen, Kontakt aufzunehmen. Für Die Passaging-Zellen das Medium absaugen und die Zellen mit einem Milliliter pro Vertiefung Enzymlösung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.Übertragen Sie die Zellen, indem Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit vier Millilitern DMEM F-12 vorgewärmt auf 37 Grad Celsius geben. Bereiten Sie 24-Well-Platten vor, indem Sie sie mit 250 Mikrolitern 1X hESC-qualifiziertem Matrigel-Medium beschichten. Samen-hESCs mit einer Dichte von 1 bis 1,5 mal 10 bis zur 5. Zellzahl pro Vertiefung in 500 Mikroliter mTESR-Medium.Fügen Sie sowohl Activin A zu einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter als auch CHIR99021 zu einer Endkonzentration von drei Mikromolaren in einem geeigneten Volumen des vorgewärmten Differenzierungsgrundmediums der Stufe eins hinzu. Nach drei Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen Marker definitiver Endodermzellen wie FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 und FOXA1 exprimieren. Am dritten Tag der Differenzierung das Medium absaugen, durch Medium der zweiten Stufe ersetzen und 24 Stunden lang inkubieren.Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag an den Tagen vier bis acht. Nach acht Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen geeignete Marker von hepatischen Vorläuferzellen wie HNF4 alpha, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA exprimieren. Am achten Tag saugen Sie das Medium der zweiten Stufe aus den Zellen ab und ersetzen Sie es durch das Medium der stufe drei.Lassen Sie die Zellen 10 Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubieren und wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag mit frisch hinzugefügten Differenzierungsfaktoren. Nach 18 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen charakteristische Marker von Hepatozyten wie AAT, ALB, TTR, HNF4 alpha, NTCP, ASGR1, CYP3A4 exprimieren. Das schematische Diagramm von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus hESCs und Hellfeldbilder jeder Differenzierungsstufe werden gezeigt.Im ersten Stadium wurden Activin A und CHIR99021 drei Tage lang zugegeben, um Stammzellen zur Bildung von Endodermzellen zu induzieren. Im zweiten Stadium differenzierten sich die Endodermzellen zu hepatischen Vorläuferzellen, nachdem sie fünf Tage lang mit einem Differenzierungsmedium behandelt worden waren. Im dritten Stadium, nach 10 Tagen, waren frühe Hepatozyten gereift und differenzierten sich zu Hepatozyten-ähnlichen Zellen im Hepatozytenwachstumsfaktor und Oncostatin.In der letzten Phase der Differenzierung zeigten die Zellen einen typischen Hepatozytenphänotyp. RT-PCR, Immunfluoreszenzfärbung und Western Blotting wurden verwendet, um Marker von Endodermzellen, Lebervorläuferzellen und reifen Hepatozyten nachzuweisen. Die differenzierten Zellen zeigten in jedem Stadium hohe Expressionsniveaus an differenzierungsbezogenen Genen und Proteinen, wie die Endodermmarker SOX17 am dritten Tag, der Lebervorläufermarker HNF4 alpha am achten Tag, AFP am Tag 14 und der reife Hepatozytenmarker ALB am Tag 18.Die HLCs wiesen eine grüne Färbung und eine ausgedehnte Zytoplasmasäureverschiebung auf. Die Hepatozyten zeigten eine typische zweikernige Morphologie. Die enzymatische Aktivität von CYP3A4, dem essentiellen metabolischen CYP in der Leber in HLCs, wurde mit einem Enzymassay bestätigt.Die Ansiedlung menschlicher embryonaler Stammzellen in einer angemessenen Dichte und die beginnende Differenzierung zum folgenden Datum sind entscheidend. Berühren Sie im ersten Stadium das Medium vorsichtig, da die Zellen dazu neigen, nach oben zu schweben. Die Kombination von Aktivin A und anderen kleinen Molekülen kann die Differenzierungseffizienz weiter verbessern und bei diesem Verfahren reifere hepatozytenähnliche Zellen produzieren.Diese Technik kann eine Plattform bieten, um Hepatozytentransplantation, Lebergewebe-Engineering, biokünstliche Lebern und Krankheitsmodellierung zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

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HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

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Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

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Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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