Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ' 81870432 ו 81570567 X.L.Z.), (מס '81571994 P.N.S.); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס ' 2020A1515010054 כדי P.N.S.), קרן אוניברסיטת לי קה שינג Shantou (לא. L1111 2008 כדי P.N.S.). ברצוננו להודות לפרופ' סטנלי לין מהמכללה הרפואית של אוניברסיטת שאנטו על ייעוץ שימושי.

1. תחזוקת תאי גזע
הערה: פרוטוקול תחזוקת התא המתואר להלן חל על קו התא hES03 המתוחזק בשכבה מונוטלת תואמת. עבור כל הפרוטוקולים הבאים בכתב יד זה, יש לטפל בתאים תחת ארון בטיחות ביולוגי.
<ol><li>הכינו מדיום תרבית תאי גזע 1x mTesR על ידי דילול מדיום משלים 5x למדיום בסיסי mTesR.</li>
	<li>הכינו מדיום Mat...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

כאן, אנו מציגים שיטה חורגת שגורמת ל- HLCs מ- hESCs בשלושה שלבים. בשלב הראשון, Activin A ו- CHIR99021 שימשו כדי להבדיל HESCs לתוך DE. בשלב השני, KO-DMEM ו- DMSO שימשו כדי להבדיל DE לתאי אב בכבד. בשלב השלישי, HZM בתוספת HGF, OSM והידרוקורטיזון 21-hemisuccinate מלח נתרן שימשו כדי להמשיך להבדיל בין תאי אב בכבד לתוך HLCs.
יש...

הכבד הוא איבר מטבולי מאוד זה ממלא מספר תפקידים, כולל deoxidation, אחסון גליקוגן, הפרשת סינתזה של חלבונים1. פתוגנים שונים, תרופות ותושיות יכולים לגרום לשינויים פתולוגיים בכבד ולהשפיע על תפקודיו2,3. Hepatocytes, כיחידה הפונקציונלית העיקרית של הכבד, לשחק תפקיד חשוב במערכות תמיכה בכבד מלאכותי חיסול רעילות סמים. עם זאת, המשאב של hepatocytes אנושי ראשוני מוגבל בטיפול מבוסס תאים, כמו גם במחקר מחלות כבד. לכן, פיתוח מקורות חדשים של hepatocytes אנושי תפקודי הוא כיוון מחקר חשוב בתחום הרפואה רגנרטיבית. מאז 1998 כאשר hESCs הוקמו4, hESCs נחשבו נרחב על ידי חוקרים בגלל פוטנציאל הבידול המעולה שלהם (הם יכולים להבדיל לרקמות שונות בסביבה מתאימה) ודרגה גבוהה של חידוש עצמי, ובכך לספק תאי מקור אידיאליים לכבדים ביו-אפיים, השתלת hepatocyte ואפילו הנדסת רקמת כבד5.
נכון לעכשיו, יעילות בידול הכבד ניתן להגדיל מאוד על ידי העשרת endoderm6. בהבחנה שושלת של תאי גזע לתוך endoderm, רמות של גורם הגדילה טרנספורמציה β (TGF-β) איתות מסלולי איתות WNT הם הגורמים העיקריים בצומת של שלב היווצרות endoderm. הפעלה של רמה גבוהה של TGF-β ו WNT איתות יכול לקדם את הפיתוח של endoderm7,8. Activin A הוא ציטוקינים השייכים למשפחה העל TGF-β. לכן, Activin A נמצא בשימוש נרחב אינדוקציה endoderm של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה אנושי (hiPSCs) ו hESCs9,10. GSK3 הוא קינאז חלבון סרין-טרונין. חוקרים מצאו כי CHIR99021, מעכב ספציפי של GSK3β, יכול לעורר אותות WNT טיפוסי, והוא יכול לקדם בידול תאי גזע בתנאים מסוימים, מה שמרמז כי CHIR99021 יש פוטנציאל לגרימת התמיינות תאי גזע לתוך endoderm 11,12,13.
כאן אנו מדווחים על שיטה יעילה הניתנת לשחזור לגרימת הבידול היעיל של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. התוספת הרציפה של Activin A ו- CHIR99021 ייצרה כ 89.7±0.8% SOX17 (DE סמן)-תאים חיוביים. לאחר התבגרות נוספת במבחנה, תאים אלה הביעו סמנים ספציפיים בכבד ומורפולוגיה דמוית hepatocyte מופעל (מבוסס על כתמי המטוקסילין-אאוסין (H &E)) ופונקציות, כגון ספיגת ירוק אינדוקיאנין (ICG), אחסון גליקוגן ופעילות CYP3. התוצאות מראות כי hESCs ניתן להבדיל בהצלחה לתוך HLCs תפקודית בוגרת בשיטה זו והוא יכול לספק בסיס למחקר הקשורות למחלות כבד הקרנת תרופות במבחנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

הפונקציות הפוטנציאליות של תאים דמויי hepatocyte (HLCs) נגזר תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לקיים הבטחה גדולה עבור מידול מחלות ויישומי סינון תרופות. בתנאי שכאן היא שיטה יעילה הניתנת לשחזור לבידול של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. הקמת שושלת אנדודרם היא צעד מפתח בהבחנה ל- HLCs. בשיטה שלנו, אנו מווסתים את מסלולי האיתות העיקריים על ידי שכשהם רציף Activin A ו- CHIR99021 במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE), ואחריו דור של תאי אב כבד, ולבסוף HLCs עם מורפולוגיה hepatocyte טיפוסי בשיטה stagewise עם ריאגנטים מוגדרים לחלוטין. ה- HLCs הנגזרים מ- hESC המיוצרים על-ידי שיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לבמה (כולל אלבומין, קולטן גרעיני HNF4α, ונתרן טאורוכולאט cotransporting פוליפפטיד (NTCP)), ולהראות מאפיינים מיוחדים הקשורים hepatocytes בוגרת ותפקודית (כולל כתמים ירוקים אינדוקיאנין, אחסון גליקוגן, כתמי המטוקסילין-אאוסין ופעילות CYP3), והוא יכול לספק פלטפורמה לפיתוח יישומים מבוססי HLC במחקר של מחלות כבד.

הדיאגרמה הסכימטית של אינדוקציה HLC מ- hESCs ותמונות שדה בהיר מייצגות של כל שלב בידול מוצגות באיור 1. בשלב I, Activin A ו- CHIR99021 נוספו במשך 3 ימים כדי לגרום לתאי גזע ליצור תאי אנדודרם. בשלב II, תאי אנדודרם מובחנים לתאי אב בכבד לאחר שטופלו במדיום בידול במשך 5 ימים. בשלב III, הפטוציטים מוקדמים ...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידול של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים (HLCs) על ידי השלמת Activin A ו- CHIR99021 באופן רציף במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE).

שיטה יעילה לאינדוקציה מכוונת של תאים דמויי הפטוציטים מתאי גזע עובריים אנושיים

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

תאי גזע עובריים אנושיים שמקורם בהפטוציטים שימושיים במודלים של מחלות ובהקרנת תרופות. זוהי שיטה יעילה הניתנת לשחזור לגרימת הבידול היעיל של תאי גזע עובריים אנושיים לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים. מעמד לא מובחן ומכלול מתאים של תאי גזע עובריים אנושיים הם קריטיים לבידול מוצלח לתאים דמויי hepatocyte.לתחזוקת תאי גזע, מעיל סטרילי שש באר רקמה תרבית מטופלים צלחות עם מיליליטר אחד של 1X תא גזע עוברי אנושי מוסמך Matrigel לכל באר, ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה. השאירו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. להפשיר את HESEs השתמר קריו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות ללא רועד, ואז מיד להעביר את תאי הגזע על ידי צינור אותם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של מראש מחומם, 37 מעלות צלזיוס mTESR בינוני.צנטריפוגה HESEs ולשאוף את supernatant, ואז בעדינות להשעות מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום mTESR. שאפת את מדיום ה-DMEM F-12 מהצלחת. זרע את התאים לתוך צלחת שש באר בצפיפות של 1 x 10 לתאים 5 בשני מיליליטר של mTESR, ואת הדגירה באינקובטור 5% פחמן דו חמצני.שמור על התאים על ידי החלפת המדיום במדיום mTESR שחומם מראש מדי יום. מעבר התאים בערך 70 עד 80% מפגש, או כאשר מושבות התא מתחילות ליצור קשר. עבור תאים חולפים, לשאוף את המדיום דגירה התאים עם מיליליטר אחד לכל באר של פתרון אנזים במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.העבר את התאים על ידי צינור אותם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של DMEM F-12 שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. הכינו צלחות של 24 בארות על ידי ציפוין עם 250 מיקרוליטרים של מדיום Matrigel מוסמך 1X HESC. זרעי hESCs בצפיפות של 1 עד 1.5 פעמים 10 לתאים 5 לכל באר ב 500 מיקרוליטרים של מדיום mTESR.הוסף את שני activin A לריכוז הסופי של 100 ננוגרם למיליליטר ו CHIR99021 לריכוז הסופי של שלושה micromolar בנפח המתאים של מדיום בידול שלב אחד שחומם מראש. לאחר שלושה ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים של תאים אנדודרמים סופיים, כגון FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 ו- FOXA1. ביום השלישי של הבידול, שואפים את המדיום, מחליפים אותו בשלב 2 בינוני, ומדגרים במשך 24 שעות.שנה את המדיום כל יומיים בימים 4 עד 8. לאחר שמונה ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים מתאימים של תאי אב בכבד, כגון HNF4 אלפא, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. ביום השמיני, שאף את המדיום שלב 2 מהתאים, והחלף אותו באמצעי שלב 3.אפשר לתאים להדגיר במשך 10 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני, ולשנות את התקשורת כל יומיים עם גורמי בידול טריים הוסיף. לאחר 18 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים אופייניים של hepatocytes, כגון AAT, ALB, TTR, HNF4 אלפא, NTCP, ASGR1, CYP3A4. מוצגת הדיאגרמה הסכימטית של תאים דמויי hepatocyte מ- hESCs ותמונות שדה בהירות של כל שלב בידול.בשלב הראשון, activin A ו- CHIR99021 נוספו במשך שלושה ימים כדי לגרום לתאי גזע ליצור תאי אנדודרם. בשלב השני, תאי האנדודרם מובחנים לתאי אב בכבד לאחר שטופלו במדיום בידול במשך חמישה ימים. בשלב השלישי, לאחר 10 ימים, הפטוציטים מוקדמים התבגרו והתבדלו לתאים דמויי hepatocyte בגורם הגדילה hepatocyte ו oncostatin.בשלב הסופי של הבידול, התאים הראו פנוטיפ hepatocyte טיפוסי. RT-PCR, כתמי כשל חיסוני, כתמים מערביים שימשו לגילוי סמנים של תאים אנדודרם, תאי מבשר הכבד, ו hepatocytes בוגרת. התאים המובחנים הראו רמות ביטוי גבוהות של גנים וחלבונים הקשורים לבידול בכל שלב, כגון סמני אנדודרם SOX17 ביום השלישי, סמן מבשר הכבד HNF4 אלפא ביום שמונה, AFP ביום 14, וסמן hepatocyte בוגר ALB ביום 18.ה-HLCs הציגו כתמים ירוקים וכתמים נרחבים של חומצה ציטופלסמית. ההפטוציטים הראו מורפולוגיה דו-גרעינית טיפוסית. הפעילות האנזימטית של CYP3A4, CYP מטבולי חיוני בכבד בHLCs, אושרה עם מבחני אנזים.ישיבה של תאי גזע עובריים אנושיים בצפיפות מתאימה והתחילת הבידול בתאריך הבא הם קריטיים. בשלב הראשון, גע במדיה בעדינות מכיוון שהתאים נוטים לצוף למעלה. השילוב של activin A ומולקולות קטנות אחרות עשוי לשפר עוד יותר את יעילות הבידול, ולייצר תאים בוגרים יותר דמויי hepatocyte בהליך זה.טכניקה זו יכולה לספק פלטפורמה לחקור השתלת hepatocyte, הנדסת רקמת כבד, כבדים bioartificial, ומידול מחלות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...