Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
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इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 81870432 और एक्स.एल.जेड) 81570567) द्वारा समर्थित किया गया था, (पी.एन.एस.) के लिए 81571994; गुआंगदोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, चीन (नंबर 2020A1515010054 से P.N.S.), ली का शिंग शांतोउ विश्वविद्यालय फाउंडेशन (नहीं । L1111 2008 से P.N.S.) । हम शंतू यूनिवर्सिटी मेडिकल कॉलेज के प्रो स्टेनली लिन को उपयोगी सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

1. स्टेम सेल रखरखाव
नोट: नीचे वर्णित सेल रखरखाव प्रोटोकॉल एक अनुयायी मोनोलेयर में बनाए गए एचईएस03 सेल लाइन पर लागू होता है। इस पांडुलिपि में सभी निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए, कोशिकाओं को जैविक स?...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

यहां, हम एक स्टेपवाइज विधि पेश करते हैं जो एचएलसी से एचएलसी को तीन चरणों में प्रेरित करता है। पहले चरण में, एक्टिविन ए और चिर99021 का उपयोग एचईसी को डीई में अंतर करने के लिए किया गया था। दूसरे चरण में, KO-DMEM और DMSO ...

जिगर एक अत्यधिक मेटाबोलिक अंग है जो कई भूमिकाएं निभाता है, जिसमें देवक्सिडेशन, ग्लाइकोजन का भंडारण, और प्रोटीन का स्राव और संश्लेषण शामिल है1। विभिन्न रोगजनकों, दवाओं और वंशागतता जिगर में रोग परिवर्तन पैदा कर सकता है और इसके कार्यों को प्रभावित कर सकता है2,3। हेपेटोसाइट्स, जिगर की मुख्य कार्यात्मक इकाई के रूप में, कृत्रिम यकृत समर्थन प्रणाली और दवा विषाक्तता उन्मूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स का संसाधन सेल-आधारित चिकित्सा के साथ-साथ यकृत रोग अनुसंधान में सीमित है। इसलिए, कार्यात्मक मानव हेपेटोसाइट्स के नए स्रोतों का विकास पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान दिशा है। 1 99 8 से जब एचईएससी की स्थापना की गई है4,एचएससी को शोधकर्ताओं द्वारा उनकी बेहतर भेदभाव क्षमता (वे उपयुक्त वातावरण में विभिन्न ऊतकों में अंतर कर सकते हैं) और उच्च स्तर के आत्म-नवीनीकरण के कारण व्यापक रूप से विचार किया गया है, और इस प्रकार बायोआर्टिशियल लिवर, हेपेटोसिटे प्रत्यारोपण और यहां तक कि यकृत ऊतक इंजीनियरिंग5के लिए आदर्श स्रोत कोशिकाएं प्रदान करते हैं।
वर्तमान में, एंडोडर्म6को समृद्ध करके हेपेटिक भेदभाव दक्षता को बहुत बढ़ाया जा सकता है। एंडोडर्म में स्टेम सेल के वंश भेदभाव में, परिवर्तन विकास कारक β (टीजीएफ-β) सिग्नलिंग और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग रास्ते के स्तर एंडोडर्म गठन चरण के नोड में प्रमुख कारक हैं। टीजीएफ-β और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के उच्च स्तर के सक्रियण से एंडोडर्म7,8के विकास को बढ़ावा मिल सकता है। एक्टिविन ए टीजीएफ-β सुपरफैमिली से संबंधित एक साइटोकिन है। इसलिए, एक्टिविन ए का व्यापक रूप से मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) और एचएसएससी9,10के एंडोडर्म प्रेरण में उपयोग किया जाता है। जीएसके3 एक सेरीन-थ्रेनिन प्रोटीन काइनेज है। शोधकर्ताओं ने पाया है कि GSK3ο के एक विशिष्ट अवरोधक CHIR99021, विशिष्ट WNT संकेतों को प्रोत्साहित कर सकते हैं, और कुछ शर्तों के तहत स्टेम सेल भेदभाव को बढ़ावा दे सकते हैं, सुझाव है कि CHIR99021 endoderm 11,12,13में स्टेम सेल भेदभाव उत्प्रेरण के लिए क्षमता है ।
यहां हम एचईसी के भेदभाव को कार्यात्मक एचएलसी में प्रभावी रूप से प्रेरित करने के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य विधि की रिपोर्ट करते हैं। एक्टिविन ए और CHIR99021 के अनुक्रमिक इसके अलावा लगभग 89.7±.0.8% SOX17 (DE मार्कर) सकारात्मक कोशिकाओं का उत्पादन किया। विट्रो मेंऔर परिपक्व होने के बाद, इन कोशिकाओं ने हेपेटोटिक विशिष्ट मार्कर व्यक्त किए और हेपेटोसाइट जैसी आकृति विज्ञान (हेमटॉक्सीलिन-इओसिन स्टेनिंग (एच एंड ई) पर आधारित) और इंडोसायनाइन ग्रीन (आईसीजी), ग्लाइकोजन स्टोरेज और एसआईपी 3 गतिविधि के तेज जैसे कार्यों को लागू किया। परिणाम बताते हैं कि एचईएससी को इस विधि से परिपक्व कार्यात्मक एचएलसी में सफलतापूर्वक विभेदित किया जा सकता है और यह यकृत रोग से संबंधित अनुसंधान और इन विट्रो दवा स्क्रीनिंग के लिए एक आधार प्रदान कर सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) से प्राप्त हेपेटोसिटे जैसी कोशिकाओं (एचएलसी) के संभावित कार्य रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए महान वादा रखते हैं। यहां प्रदान की गई कार्यात्मक एचएलसी में एचईसी के भेदभाव के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य विधि है। एक एंडोडर्म वंश की स्थापना एचएलसी के लिए भेदभाव में एक महत्वपूर्ण कदम है। हमारी विधि से, हम एचईएससी भेदभाव के दौरान सक्रियता ए और CHIR99021 को निश्चित एंडोडर्म (डीई) में लगातार पूरक करके प्रमुख सिग्नलिंग रास्तों को विनियमित करते हैं, जिसके बाद हेपेटिक जनक कोशिकाओं की पीढ़ी, और अंत में पूरी तरह से परिभाषित अभिजेंटों के साथ एक चरणवार विधि में ठेठ हेपेटोसाइट आकृति विज्ञान के साथ एचएलसी। इस विधि द्वारा उत्पादित एचईएससी-व्युत्पन्न एचएलसी चरण-विशिष्ट मार्कर (एल्बुमिन सहित, एचएनएफ 4α परमाणु रिसेप्टर, और सोडियम टैरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी)), और परिपक्व और कार्यात्मक हेपेटोसाइट्स (इंडोसायनीन ग्रीन स्टेनिंग, ग्लाइकोजन स्टोरेज, हेमटॉक्सीलिन-ईओसिन स्टेनिंग और एसआईपी 3 गतिविधि सहित) से संबंधित विशेष विशेषताओं को दिखाते हैं, और यकृत रोगों के अध्ययन में एचएलसी आधारित अनुप्रयोगों के विकास के लिए एक मंच प्रदान कर सकते हैं।

एचईसी से एचएलसी इंडक्शन का योजनाबद्ध आरेख और प्रत्येक भेदभाव चरण के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को चित्र 1में दिखाया गया है। स्टेज I में, एक्टिविन ए और CHIR99021 को 3 दिनों के लिए जोड़ा गया था ?...

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An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

यह पांडुलिपि निश्चित एंडोडर्म (डीई) में एचएससी भेदभाव के दौरान सक्रियता ए और चिर 9 9 021 को लगातार पूरक करके कार्यात्मक हेपेटोसिट जैसी कोशिकाओं (एचएलसी) में मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (एचईसी) के भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से निर्देशित हेपेटोसिटे-लाइक सेल इंडक्शन के लिए एक कुशल विधि

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

मानव भ्रूणस्टेम कोशिका-व्युत्पन्न हेपेटोसिट जैसी कोशिकाएं रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग में उपयोगी होती हैं। यह मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को कार्यात्मक हेपेटोसिट जैसी कोशिकाओं में प्रभावी ढंग से प्रेरित करने के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य विधि है। एक अविभेदित स्थिति और मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं के उपयुक्त संगम हेपेटोसिट की तरह कोशिकाओं के लिए एक सफल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं ।स्टेम सेल रखरखाव के लिए, कोट बाँझ छह अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति-1X मानव भ्रूण स्टेम सेल के एक मिलीलीटर के साथ प्लेटों का इलाज-योग्य Matrigel प्रति अच्छी तरह से, और उंहें चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर । उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को छोड़ दें। एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में क्रायो संरक्षित HESEs गल बिना तीन मिनट के लिए मिलाते हुए, तो तुरंत उंहें एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पाइपिंग द्वारा स्टेम कोशिकाओं को स्थानांतरित पूर्व गरम, ३७ डिग्री सेल्सियस mTESR माध्यम के चार मिलीलीटर युक्त ।HESEs को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को स्थगित करें, फिर धीरे-धीरे एमटीईएसआर माध्यम के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। थाली से डीएमईएम एफ-12 माध्यम को एस्पिरेट करें। कोशिकाओं को 1 x 10 के घनत्व पर एक छह अच्छी तरह से प्लेट में बीज mTESR के दो मिलीलीटर में 5 कोशिकाओं को, और एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट ।दैनिक प्रीहीटेड एमटीटीआर माध्यम के साथ माध्यम को बदलकर कोशिकाओं को बनाए रखें। लगभग 70 से 80% संगम पर कोशिकाओं को मार्ग, या जब सेल कालोनियों से संपर्क करना शुरू करते हैं। कोशिकाओं के लिए पासिंग, मध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को एंजाइम समाधान के प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पिपिंग करके स्थानांतरित करें जिसमें डीएमईएम एफ-12 के चार मिलीलीटर पूर्व-गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस तक होते हैं । 1X एचईएससी-क्वालिफाइड मैट्रिगेल मीडियम के 250 माइक्रोलीटर के साथ उन्हें कोटिंग करके 24-वेल प्लेट्स तैयार करें। एमटीईएसआर माध्यम के 500 माइक्रोलीटर में 5 वीं कोशिकाओं को 1 से 1.5 गुना 10 के घनत्व पर बीज एचईसी।पहले से गरम चरण एक भेदभाव बुनियादी माध्यम की एक उपयुक्त मात्रा में तीन माइक्रोमॉलर की अंतिम एकाग्रता के लिए 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर और CHIR99021 की अंतिम एकाग्रता के लिए दोनों एक्टिविन ए जोड़ें। तीन दिनों के भेदभाव के बाद, विभेदित कोशिकाओं को निश्चित एंडोडर्म कोशिकाओं के मार्कर व्यक्त करने चाहिए, जैसे FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4, और FOXA1। भेदभाव के तीसरे दिन, माध्यम को आकांक्षी करें, इसे चरण दो माध्यमों से प्रतिस्थापित करें, और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।चार से आठ के माध्यम से चार दिन पर हर दूसरे दिन माध्यम बदलें । विभेदित कोशिकाओं को एचएनएफ4 अल्फा, एएफपी, टीबीएक्स3, टीटीआर, एएलबी, एनटीसीपी, सीईबीपीए जैसी हेपेटिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं के उपयुक्त मार्कर व्यक्त करने चाहिए । आठ दिन, कोशिकाओं से मंच दो माध्यम आकांक्षी, और यह चरण तीन माध्यम के साथ बदलें ।कोशिकाओं को कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 दिनों के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, और हौसले से जोड़े गए भेदभाव कारकों के साथ हर दूसरे दिन मीडिया को बदलें । भेदभाव के 18 दिनों के बाद, विभेदित कोशिकाओं को एएटी, एएलबी, टीटीआर, एचएनएफ4 अल्फा, एनटीसीपी, एएसजीआर 1, CYP3A4 जैसे हेपेटोसाइट्स के विशिष्ट मार्कर व्यक्त करने चाहिए। एचईसी से हेपेटोसिट जैसी कोशिकाओं के योजनाबद्ध आरेख और प्रत्येक विभेदन चरण की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को दिखाया गया है।स्टेज वन में स्टेम सेल को एंडोडर्म सेल बनाने के लिए प्रेरित करने के लिए तीन दिन के लिए एक्टिविन ए और चिर99021 को जोड़ा गया । चरण दो में, एंडोडर्म कोशिकाओं को पांच दिनों के लिए एक भेदभाव माध्यम के साथ इलाज किया जा रहा है के बाद हेपेटिक जनक कोशिकाओं में विभेदित । चरण तीन में, 10 दिनों के बाद, शुरुआती हेपेटोसाइट्स परिपक्व हो गए थे और हेपेटोसाइट विकास कारक और ओन्कोस्टैटिन में हेपेटोसिट जैसी कोशिकाओं में विभेदित थे।भेदभाव के अंतिम चरण में, कोशिकाओं ने एक ठेठ हेपेटोसिट फेनोटाइप दिखाया। आर टी-पीसीआर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और पश्चिमी दाग का उपयोग एंडोडर्म कोशिकाओं, हेपेटिक अग्रदूत कोशिकाओं और परिपक्व हेपेटोसाइट्स के मार्कर का पता लगाने के लिए किया जाता था। विभेदित कोशिकाओं ने प्रत्येक चरण में भेदभाव से संबंधित जीन और प्रोटीन के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को दिखाया, जैसे कि तीन दिन में एंडोडर्म मार्कर SOX17, दिन आठ में हेपेटिक अग्रदूत मार्कर एचएनएफ4 अल्फा, 14 दिन में एएफपी, और 18 दिन में परिपक्व हेपेटोसिट मार्कर एएलबी ।एचएलसी ने हरे रंग के धुंधला और व्यापक साइटोप्लाज्मिक एसिड शिफ्ट धुंधला प्रदर्शित किया। हेपेटोसाइट्स ने ठेठ द्वि-नाभिकित आकृति विज्ञान दिखाया। CYP3A4 की एंजाइमेटिक गतिविधि, एचएलसी में जिगर में आवश्यक मेटाबोलिक सीईपी, एंजाइम परख के साथ पुष्टि की गई थी।एक उपयुक्त घनत्व पर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की बैठना और निम्नलिखित तिथि पर भेदभाव शुरू करना महत्वपूर्ण है। एक चरण में, मीडिया को धीरे से स्पर्श करें क्योंकि कोशिकाओं को तैरने का खतरा है। एक्टिविन ए और अन्य छोटे अणुओं का संयोजन भेदभाव क्षमता में और सुधार कर सकता है, और इस प्रक्रिया में अधिक परिपक्व हेपेटोसिट जैसी कोशिकाओं का उत्पादन कर सकता है।यह तकनीक हेपेटोसिटे प्रत्यारोपण, यकृत ऊतक इंजीनियरिंग, बायोआर्टिफिशियल लिवर और रोग मॉडलिंग का पता लगाने के लिए एक मंच प्रदान कर सकती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

एक सरल और कुशल वयस्क जिगर की कोशिकाओं के मिश्रित प्राथमिक संस्कृति से मैक्रोफेज पृथक विधि

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

सेल परिपक्वता के बिना वृक्ष के समान कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

एचएलए पुलिस महानिरीक्षक के आधार पर कुशल के लिए कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पूर्व vivo मानव सीटीएल का विस्तार

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

टी lymphocytes की ओर प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की निर्देशित भेदभाव

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

कुशल के लिए खूनी कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं (KaAPC)<em&gt; इन विट्रो</em&gt; मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की कमी

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

टी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति<em&gt; इन विट्रो</em&gt; माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में एक Oligodendrocyte का निर्देशन टी-सेल हमले के मॉडल

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

माउस तिल्ली से अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं को अलग करने और विस्तार के लिए एक अनुकूलित विधि

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

संक्रामक रोगों के लिए मॉडल के रूप में Organoids: हेलिकोबेक्टर के मानव की संस्कृति और murine पेट Organoids और microinjection

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

मानव तालु Tonsils से बी और टी lymphocytes के लिए कुशल अलगाव प्रोटोकॉल

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...