Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81870432 e 81570567 to X.L.Z.), (n. 81571994 to P.N.S.); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (n. 2020A1515010054 a P.N.S.), La Fondazione Universitaria Li Ka Shing Shantou (n. L1111 dal 2008 al P.N.S.). Desideriamo ringraziare il Prof. Stanley Lin dello Shantou University Medical College per i consigli utili.

1. Manutenzione delle cellule staminali
NOTA: Il protocollo di manutenzione delle celle descritto di seguito si applica alla linea cellulare hES03 mantenuta in un monostrato aderente. Per tutti i seguenti protocolli in questo manoscritto, le celle devono essere maneggiate sotto un armadietto di sicurezza biologico.
<ol><li>Preparare un mezzo di coltura di cellule staminali 1x mTesR diluire 5x mezzo supplementare a mTesR mezzo di base.</li>
	<li>Preparare un supporto Matrigel qualificato 30x ...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Qui presentiamo un metodo graduale che induce gli HLC dagli hESC in tre fasi. Nella prima fase, Activin A e CHIR99021 sono stati utilizzati per differenziare gli hESC in DE. Nel secondo stadio, KO-DMEM e DMSO sono stati usati per differenziare DE in cellule progenitrici epatiche. Nel terzo stadio, HZM più HGF, OSM e sale di sodio idrocortisone 21-emisuccinato sono stati usati per continuare a differenziare le cellule progenitrici epatiche in HHC.
Durante l'utilizzo del protocollo è necessari...

Il fegato è un organo altamente metabolico che svolge diversi ruoli, tra cui la disossidazione, la conservazione del glicogeno e la secrezione e la sintesi delle proteine1. Vari agenti patogeni, farmaci ed eremita possono causare cambiamenti patologici nel fegato e influenzare le suefunzioni 2,3. Gli epatociti, come principale unità funzionale del fegato, svolgono un ruolo importante nei sistemi di supporto epatico artificiale e nell'eliminazione della tossicità dei farmaci. Tuttavia, la risorsa degli epatociti umani primari è limitata nella terapia a base cellulare, così come nella ricerca sulle malattie del fegato. Pertanto, lo sviluppo di nuove fonti di epatociti umani funzionali è un'importante direzione di ricerca nel campo della medicina rigenerativa. Dal 1998, quando gli hESCsono stati istituiti 4, gli hESC sono stati ampiamente considerati dai ricercatori a causa del loro potenziale di differenziazione superiore (possono differenziarsi in vari tessuti in un ambiente adatto) e dell'alto grado di autorela rinnovabilità, e quindi forniscono cellule di origine ideali per epatici bioartifici, trapianto di epatociti e persino ingegneria del tessutoepatico 5.
Attualmente, l'efficienza di differenziazione epatica può essere notevolmente aumentata arricchendo l'endoderma6. Nella differenziazione del lignaggio delle cellule staminali in endoderma, i livelli del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e le vie di segnalazione WNT sono i fattori chiave nel nodo dello stadio di formazione dell'endoderma. L'attivazione di un alto livello di segnalazione TGF-β e WNT può promuovere lo sviluppo di endoderm7,8. Activin A è una citochina appartenente alla superfamiglia TGF-β. Pertanto, l'attivina A è ampiamente utilizzata nell'induzione endoderma di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) ehESC 9,10. La GSK3 è una proteina chinasi serina-treonina. I ricercatori hanno scoperto che CHIR99021, uno specifico inibitore di GSK3β, può stimolare i tipici segnali WNT e può promuovere la differenziazione delle cellule staminali in determinate condizioni, suggerendo che CHIR99021 ha il potenziale per indurre la differenziazione delle cellule staminali in endoderma 11,12,13.
Qui riferiamo un metodo efficiente e riproducibile per indurre efficacemente la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L'aggiunta sequenziale di Activin A e CHIR99021 ha prodotto circa 89,7±0,8% cellule SOX17 (marcatore DE)positive. Dopo essere state ulteriormente maturate in vitro, queste cellule hanno espresso marcatori specifici epatici e esercitato morfologia epatocitaria (basata sulla colorazione ematossilina-eosina (H & E)) e funzioni, come l'assorbimento di verde indocyanina (ICG), stoccaggio di glicogeno e attività CYP3. I risultati mostrano che gli hESC possono essere differenziati con successo in HHC funzionali maturi con questo metodo e possono fornire una base per la ricerca correlata alle malattie epatiche e lo screening in vitro dei farmaci.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

Le potenziali funzioni delle cellule simili agli epatociti (HLC) derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) promettono molto per la modellazione delle malattie e le applicazioni di screening farmacologico. Ecco un metodo efficiente e riproducibile per la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L'istituzione di un lignaggio endodermo è un passo fondamentale nella differenziazione agli HLC. Con il nostro metodo, regolamentiamo le vie di segnalazione chiave integrando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE), seguita dalla generazione di cellule progenitrici epatiche e infine HHC con morfologia tipica degli epatociti in un metodo scenico con reagenti completamente definiti. Gli HHLC derivati dall'hESC prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del palco (tra cui albumina, Il recettore nucleare HNF4α e il polipeptide cotrasportante taurocorato di sodio (NTCP)) e mostrano caratteristiche speciali relative agli epatociti maturi e funzionali (tra cui colorazione verde indocyanina, stoccaggio di glicogeno, colorazione ematossilina-eosina e attività CYP3) e possono fornire una piattaforma per lo sviluppo di applicazioni basate su HLC nello studio delle malattie epatiche.

Il diagramma schematico dell'induzione HLC dagli hESC e le immagini rappresentative dei campi luminosi di ogni fase di differenziazione sono mostrati nella figura 1. Nella fase I, l'attivina A e il CHIR99021 sono stati aggiunti per 3 giorni per indurre le cellule staminali a formare cellule endodermiche. Nello stadio II, le cellule endodermiche si differenziano in cellule progenitrici epatiche dopo essere state trattate con mezzo di differenziazione per 5 giorni. Nella terza fase, i primi ep...

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An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Le cellule epatociti derivate da cellule staminali embrionali umane sono utili nella modellazione delle malattie e nello screening farmacologico. Si tratta di un metodo efficiente e riproducibile per indurre efficacemente la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in cellule funzionali simili a epatociti. Uno stato indifferenziato e un'adeguata confluenza di cellule staminali embrionali umane sono fondamentali per una differenziazione riuscita alle cellule simili agli epatociti.Per il mantenimento delle cellule staminali, rivestire piastre sterili trattate con coltura tissutale a sei pozzi con un millilitro di Matrigel qualificato per cellule staminali embrionali umane 1X per pozzo e conservarle a quattro gradi Celsius durante la notte. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Scongelare gli HESE crioconsenti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per tre minuti senza tremare, quindi trasferire immediatamente le cellule staminali intubandole in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo mTESR preri warmed di 37 gradi Celsius.Centrifugare gli HESE e aspirare il supernatante, quindi sospendere delicatamente le cellule in un millilitro di mezzo mTESR. Aspirare il mezzo DMEM F-12 dalla piastra. Seminare le cellule in una piastra a sei potte ad una densità di 1 x 10 fino alla 5a cellule in due millilitri di mTESR e incubare in un incubatore di anidride carbonica al 5%.Mantenere le cellule sostituendo il mezzo con mezzo mTESR preriscaldato ogni giorno. Passare le cellule a circa il 70-80% di confluenza, o quando le colonie cellulari iniziano a prendere contatto. Per le cellule che passano, aspirare il mezzo e incubare le cellule con un millilitro per pozzo di soluzione enzimatica per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Trasferire le cellule tubazioni in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente quattro millilitri di DMEM F-12 prerifatti a 37 gradi Celsius. Preparare piastre da 24 pozzi rivestendole con 250 microlitri di supporto Matrigel qualificato hESC 1X. Seme hESC ad una densità da 1 a 1,5 volte 10 alla 5a cellule per pozzo in 500 microlitri di mezzo mTESR.Aggiungere entrambe le attività A ad una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro e CHIR99021 ad una concentrazione finale di tre micromolari in un volume appropriato di mezzo di base di differenziazione preriscaldato di fase uno. Dopo tre giorni di differenziazione, le cellule differenziate dovrebbero esprimere marcatori di cellule endodermiche definitive, come FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 e FOXA1. Il terzo giorno di differenziazione, aspirare il mezzo, sostituirlo con il mezzo di fase due e incubare per 24 ore.Cambia il mezzo a giorni dal quattro all'otto giorni. Dopo otto giorni di differenziazione, le cellule differenziate dovrebbero esprimere marcatori appropriati di cellule progenitrici epatiche, come HNF4 alpha, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. Il primo giorno, aspirare il mezzo di fase due dalle cellule e sostituirlo con il mezzo di fase tre.Consentire alle cellule di incubare per 10 giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica e cambiare i media a giorni diversi con fattori di differenziazione appena aggiunti. Dopo 18 giorni di differenziazione, le cellule differenziate dovrebbero esprimere marcatori caratteristici di epatociti, come AAT, ALB, TTR, HNF4 alpha, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Viene mostrato il diagramma schematico delle cellule simili agli epatociti degli hESC e delle immagini dei campi luminosi di ogni fase di differenziazione.Nella prima fase, l'attivina A e la CHIR99021 sono state aggiunte per tre giorni per indurre le cellule staminali a formare cellule endodermiche. Nella seconda fase, le cellule endodermiche si differenziano in cellule progenitrici epatiche dopo essere state trattate con un mezzo di differenziazione per cinque giorni. Nella terza fase, dopo 10 giorni, i primi epatociti erano maturati e differenziati in cellule simili agli epatociti nel fattore di crescita degli epatociti e nell'oncostatina.Nella fase finale della differenziazione, le cellule hanno mostrato un tipico fenotipo epatocita. RT-PCR, colorazione immunofluorescenza e macchia occidentale sono stati usati per rilevare marcatori di cellule endodermiche, cellule precursori epatiche ed epatociti maturi. Le cellule differenziate hanno mostrato alti livelli di espressione di geni e proteine correlati alla differenziazione in ogni fase, come marcatori di endoderma SOX17 al terzo giorno, marcatore precursore epatico HNF4 alfa al giorno otto, AFP al giorno 14 e marcatore epatocitaro maturo ALB al giorno 18.Gli HHC mostravano colorazione verde e ampia colorazione dello spostamento dell'acido citoplasmatico. Gli epatociti mostravano una tipica morfologia bi-nucleata. L'attività enzimatica di CYP3A4, il CYP metabolico essenziale nel fegato negli HHC, è stata confermata con un saggio enzimatico.L'applicazione di cellule staminali embrionali umane ad una densità appropriata e la differenziazione iniziale alla data successiva sono fondamentali. Nella prima fase, toccare delicatamente il supporto perché le cellule sono inclini a galleggiare verso l'alto. La combinazione di attivina A e altre piccole molecole può migliorare ulteriormente l'efficienza di differenziazione e produrre cellule simili a epatociti più mature in questa procedura.Questa tecnica può fornire una piattaforma per esplorare il trapianto di epatociti, l'ingegneria dei tessuti epatici, i fegati bioartificiali e la modellazione delle malattie.

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