Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(X.L.Z.에 81870432 및 81570567)에 의해 지원되었다(81571994 P.N.S.; 중국 광동성 자연과학재단(2020A1515010054호P.N.S.), 리카싱산투대학 재단(No. L1111 2008 - P.N.S.). 샨투 대학 의과 대학의 스탠리 린 교수에게 유용한 조언을 구해 주셔서 감사합니다.

1. 줄기 세포 유지 보수
참고: 아래에 설명된 세포 유지 보수 프로토콜은 부착된 단층에서 유지되는 hES03 세포주에 적용됩니다. 이 원고의 모든 다음 프로토콜에 대해 세포는 생물학적 안전 캐비닛에서 처리되어야합니다.
<ol><li>mTesR 기본 배지에 5배 보충 배지를 희석하여 1배 mTesR 줄기 세포 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>얼음 에 DMEM / F12의 5 mLhESC 자격을 갖춘 5 mL을 희석하여 3...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

여기서는 hESC에서 HLC를 3단계로 유도하는 단계적 방법을 제시합니다. 첫 번째 단계에서액티빈 A와 CHIR99021은 hESC를 DE로 차별화하는 데 사용되었습니다. 두 번째 단계에서, KO-DMEM 및 DMSO는 간 선조 세포로 DE를 분화하기 위하여 이용되었습니다. 제 3 단계에서, HZM 플러스 HGF, OSM 및 하이드로 코르티손 21-hemisuccinate 나트륨 소금은 HLC로 간 선조 세포를 계속 분화하는 데 사용되었다.
?...

간은 탈산화, 글리코겐 저장, 단백질1의분비 및 합성을 포함하여 여러 가지 역할을 하는 매우 신진 대사 기관이다. 각종 병원균, 약물 및 항종은 간에서 병리학적 변화를 일으킬 수 있으며 그 기능에 영향을 미칠 수있습니다2,3. 간장의 주요 기능 단위인 간세포는 인공 간 지원 시스템 및 약물 독성 제거에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 1 차적인 인간 간세포의 자원은 간 질병 연구에서 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 치료에서 제한됩니다. 따라서 기능성 인간 간세포의 새로운 소스를 개발하는 것은 재생 의학 분야에서 중요한 연구 방향입니다. 1998년 hESC가 설립된 이래4년이래, hESC는 우수한 분화 잠재력(적절한 환경에서 다양한 조직으로 분화할 수 있음) 및 높은 수준의 자기 갱신성 으로 인해 연구자들이 널리 고려해 왔으며, 따라서 생체인공간, 간세포 이식, 심지어 간 조직 공학5에이상적인 공급세포를 제공한다.
현재, 간 분화 효율은 엔도름6을농축함으로써 크게 증가할 수 있다. 줄기 세포의 혈통 분화에서 엔데담으로, β 변형 성장 인자 (TGF-β) 신호 및 WNT 신호 경로의 수준은 엔도름 형성 단계의 노드의 핵심 요소입니다. 높은 수준의 TGF-β 및 WNT 시그널링의 활성화는 엔도름7,8의개발을 촉진할 수 있다. 액티빈 A는 TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 사이토카인입니다. 따라서, 액티빈 A는 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC) 및 hESC9,10의엔도름유도에널리 사용된다. GSK3는 세린-토닌 단백질 키나아제입니다. 연구원은 CHIR99021, GSK3β의 특정 억제제, 전형적인 WNT 신호를 자극할 수 있고, 특정 조건하에서 줄기 세포 분화를 촉진할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다, CHIR99021는 endoderm 11,12,13로줄기 세포 분화를 유도하기위한 잠재력을 가지고 있음을 시사.
여기서 는 hESC를 기능형 HLC로 효과적으로 차별화하는 효율적이고 재현 가능한 방법을 보고합니다. 액티빈 A와 CHIR99021의 순차적 첨가는 약 89.7±0.8% SOX17(DE 마커)-양성 세포를 생산하였다. 시험관에서추가 로 소화 된 후, 이들 세포는 간 특이적 마커를 발현하고 간세포와 같은 형태 (헤마톡시린 -eosin 염색 (H & E)에 기초하여) 및 기능, 인도시아닌 녹색 (ICG), 글리코겐 저장 및 CYP3 활성등의 섭취와 같은 기능. 결과는 hESC가 이 방법에 의해 성숙한 기능적인 HLC로 성공적으로 분화될 수 있고 간 질병 관련 연구 및 체외약 검열을 위한 기초를 제공할 수 있다는 것을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

인간 배아 줄기 세포 (hESC)에서 파생 된 간세포와 같은 세포 (HLC)의 잠재적 인 기능은 질병 모델링 및 약물 선별 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 여기에 제공 기능 용 HLC로 hESC의 분화를위한 효율적이고 재현 가능한 방법이 있습니다. 엔도름 혈통의 확립은 HLC와 차별화의 핵심 단계입니다. 우리의 방법에 의해, 우리는 지속적으로 최종 엔도담 (DE)로 hESC 분화 하는 동안 Activin A와 CHIR99021을 보충 하 여 주요 신호 경로를 조절 하 고, 간 선조 세포의 생성 에 이어, 그리고 마지막으로 완전히 정의 된 시약을 가진 단계 별 방법으로 전형적인 간세포 형태와 HLCs. 이 방법에 의해 생성된 hESC 유래 HLC는 단계별 마커(알부민 포함) 및 HNF4α 핵수용체 및 타우로콜레이트 응수송 폴리펩티드(NTCP)는 성숙하고 기능적인 간세포(인도시아닌 그린 염색, 글리코겐 저장, 헤마톡시린-에신 염색 및 CYP3 활성 포함)와 관련된 특별한 특성을 나타내며, HLC 기반의 응용 분야의 개발을 위한 플랫폼을 제공할 수 있다.

각 분화 단계의 HESC 유도 및 대표 밝은 필드 이미지의 HLC 유도의 회로도는 도 1에표시됩니다. 1단계에서, 액티빈 A와 CHIR99021은 줄기 세포를 형성하여 엔도름 세포를 형성하도록 유도하기 위해 3일 동안 첨가되었다. 단계 II에서, 엔데담 세포는 5 일 동안 분화 배지로 처리 된 후 간 선조 세포로 분화. 스테이지 III에서는 HGF 및 OSM(그림1A)에서10일 만에 초기 ?...

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An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

인간 배아 줄기 세포 유래 간세포와 같은 세포는 질병 모델링 및 약물 선별에 유용하다. 이것은 인간 배아 줄기 세포의 분화를 기능성 간세포와 같은 세포로 효과적으로 유도하기 위한 효율적이고 재현 가능한 방법입니다. 인간 배아 줄기 세포의 미분화 상태와 적절한 결합은 간세포와 같은 세포에 성공적인 분화에 매우 중요합니다.줄기 세포 유지를 위해, 외투 멸균 6 웰 조직 배양 플레이트 1 밀리리터1x 인간 배아 줄기 세포 자격을 갖춘 Matrigel 잘, 하룻밤 4섭씨에 저장. 사용 전에 플레이트를 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 저온 보존 HESEs를 37도의 수조에서 3분간 흔들어주지 않고 해동한 다음, 미리 데워진 섭씨 37도의 4밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 즉시 줄기세포를 이송합니다.HESEs를 원심분리하고 상퍼를 흡인한 다음, mTESR 배지의 1밀리리터에서 세포를 부드럽게 다시 중단합니다. 플레이트에서 DMEM F-12 배지를 흡인한다. mTESR의 2밀리리터에서 5세포에 1 x 10의 밀도로 세포를 6웰 플레이트로 시드하고, 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양한다.배지를 예열된 mTESR 배지로 매일 교체하여 세포를 유지한다. 약 70~80%의 합류또는 세포 식민지가 접촉하기 시작할 때 세포를 통과한다. 세포 통과의 경우, 배지를 흡인하고 37°C에서 5분 동안 효소 용액 당 1밀리리터로 세포를 배양합니다.DMEM F-12의 4밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 37°C까지 미리 데워집니다. 1X hESC 인증 된 Matrigel 배지의 250 마이크로 리터로 코팅하여 24 웰 플레이트를 준비하십시오. 종자 hESC는 mTESR 배지의 500 마이크로리터에서 잘 당 5 세포당 1~1.5배 10배 10배이다.활성 A를 밀리리터당 100 나노그램과 CHIR99021의 최종 농도에 모두 추가하여 예열된 단계 1분분화 기본 배지의 적절한 부피에 3개의 마이크로몰러의 최종 농도를 가집니다. 분화 3 일 후, 분화 된 세포는 FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 및 FOXA1과 같은 최종 엔도름 세포의 마커를 발현해야합니다. 분화 의 셋째 날에, 매체를 흡인, 단계 2 매체로 교체하고, 24 시간 동안 배양.4일부터 8일까지 매일 매체를 변경합니다. 분화 8 일 후, 분화 된 세포는 HNF4 알파, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA와 같은 간 선조 세포의 적절한 마커를 표현해야합니다. 8일째에, 세포로부터 2단계 배지를 흡인시키고, 3단계 배지로 대체한다.세포가 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10일 동안 배양하고, 갓 추가된 분화 요인으로 매일 미디어를 변경할 수 있습니다. 분화 18일 후, 분화세포는 AAT, ALB, TTR, HNF4 알파, NTCP, ASGR1, CYP3A4와 같은 간세포의 특징적인 마커를 발현해야 한다. hESC에서 간세포와 같은 세포의 회로도 및 각 분화 단계의 밝은 필드 이미지가 표시됩니다.1단계에서, 활성A와 CHIR99021은 줄기세포를 유도하여 내분세포를 형성하도록 유도하기 위해 3일 동안 첨가되었다. 2단계에서, 엔도름 세포는 5일 동안 분화 배지로 치료된 후 간 전구 세포로 분화하였다. 3 단계에서, 10 일 후에, 초기 간세포는 성숙하고 간구 세포 성장 인자와 온코타틴에 있는 간세포 같이 세포로 분화했습니다.분화의 마지막 단계에서, 세포는 전형적인 간세포 표현형을 보였다. RT-PCR, 면역 형광 염색 및 서양 블로팅은 엔도름 세포, 간 전구체 세포 및 성숙한 간세포의 마커를 검출하는 데 사용되었습니다. 분화세포는 3일째엔엔도름 마커 SOX17, 8일째에 는 간전구체 마커 HNF4 알파, 14일째AFP, 성숙한 간세포 마커 ALB 등 각 단계에서 분화 관련 유전자 및 단백질의 높은 발현 수준을 보였다.HLC는 녹색 염색과 광범위한 세포질 산 시프트 염색을 전시했습니다. 간세포는 전형적인 이중 핵 형태를 보였다. CYP3A4의 효소 활성, HLCs에서 간에서 필수적인 대사 CYP, 효소 분석으로 확인 되었다.적절한 밀도로 인간 배아 줄기 세포를 앉히고 다음 날짜에 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 1 단계에서 세포가 떠오르기 쉽기 때문에 미디어를 부드럽게 만지십시오. 액티비틴 A와 다른 작은 분자의 조합은 분화 효율성을 더욱 향상시키고,이 절차에서 보다 성숙한 간세포와 같은 세포를 생성할 수 있다.이 기술은 간세포 이식, 간 조직 공학, 생체 인공 간 및 질병 모델링을 탐구하는 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

연구

면역학 및 감염병학

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...