Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 og 81570567 til X.L.Z.), (Nr. 81571994 til P.N.S.); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. 2020A1515010054 til P.N.S.), Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nei. L1111 2008 til P.N.S.). Vi vil takke prof. Stanley Lin fra Shantou University Medical College for nyttige råd.

1. Vedlikehold av stamceller
MERK: Cellevedlikeholdsprotokollen som er beskrevet nedenfor, gjelder for hES03-cellelinjen som vedlikeholdes i en tilhenger monolayer. For alle følgende protokoller i dette manuskriptet bør celler håndteres under et biologisk sikkerhetsskap.
<ol><li>Forbered 1x mTesR stamcellekulturmedium ved å fortynne 5x supplerende medium til mTesR grunnleggende medium.</li>
	<li>Forbered 30x hESC-kvalifisert Matrigel medium ved å fortynne 5 ml hESC-kvalifisert matrigel ...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Her presenterer vi en trinnvis metode som induserer HLCer fra HESC-er i tre trinn. I første fase ble Activin A og CHIR99021 brukt til å differensiere hESCer i DE. I andre fase ble KO-DMEM og DMSO brukt til å skille DE inn i levergenitorceller. I tredje fase ble HZM pluss HGF, OSM og hydrokortison 21-hemisuccinat natriumsalt brukt til å fortsette å skille leverforfederceller i HLCer.
Følgende kritiske trinn må tas i betraktning når du bruker protokollen. Den første differensieringstett...

Leveren er et svært metabolsk organ som spiller flere roller, inkludert deoksidasjon, lagring av glykogen og sekresjon og syntese av proteiner1. Ulike patogener, narkotika og arvelighet kan forårsake patologiske endringer i leveren og påvirke dens funksjoner2,3. Hepatocytter, som den viktigste funksjonelle enheten i leveren, spiller en viktig rolle i kunstige leverstøttesystemer og eliminering av legemiddeltoksisitet. Imidlertid er ressursen til primære menneskelige hepatocytter begrenset i cellebasert terapi, så vel som i leversykdomsforskning. Derfor er utvikling av nye kilder til funksjonelle menneskelige hepatocytter en viktig forskningsretning innen regenerativ medisin. Siden 1998 når hESCs har blitt etablert4, hESCs har blitt mye vurdert av forskere på grunn av deres overlegne differensieringspotensial (de kan skille seg ut i ulike vev i et passende miljø) og høy grad av selvfornyelse, og dermed gi ideelle kildeceller for bioartificial lever, hepatocyttransplantasjon og til og med levervevsteknikk5.
For tiden kan leverdifferensieringseffektiviteten økes kraftig ved å berike endoderm6. I avstamningsdifferensiering av stamceller til endoderm er nivåer av den transformerende vekstfaktoren β (TGF-β) signalisering og WNT-signalveier nøkkelfaktorene i noden av endodermformasjonsstadiet. Aktivering av et høyt nivå av TGF-β og WNT-signalering kan fremme utviklingen av endoderm7,8. Activin A er en cytokin som tilhører TGF-β superfamilien. Derfor er Activin A mye brukt i endoderm induksjon av menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer) og hESCs9,10. GSK3 er en serin-threonine protein kinase. Forskere har funnet ut at CHIR99021, en spesifikk hemmer av GSK3β, kan stimulere typiske WNT-signaler, og kan fremme stamcelledifferensiering under visse forhold, noe som tyder på at CHIR99021 har potensial for å indusere stamcelledifferensiering til endoderm 11,12,13.
Her rapporterer vi en effektiv og reproduserbar metode for effektivt å indusere differensiering av hESCer til funksjonelle HLCer. Det sekvensielle tilskuddet av Activin A og CHIR99021 produserte omtrent 89,7 ±0,8% SOX17 (DE-markør)-positive celler. Etter å ha blitt ytterligere modnet in vitro, uttrykte disse cellene leverspesifikke markører og utøvde hepatocyttlignende morfologi (basert på hematoksylin-eosinfarging (H &E)) og funksjoner, for eksempel opptak av indocyaningrønn (ICG), glykogenlagring og CYP3-aktivitet. Resultatene viser at hESC-er kan differensieres til modne funksjonelle HLCer ved denne metoden og kan gi grunnlag for leversykdomsrelatert forskning og in vitro-legemiddelscreening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

De potensielle funksjonene til hepatocyttlignende celler (HLCer) avledet fra humane embryonale stamceller (hESC) har et stort løfte om sykdomsmodellering og narkotikascreening. Gitt her er en effektiv og reproduserbar metode for differensiering av hESCs i funksjonelle HLCer. Etableringen av en endoderm avledning er et viktig skritt i differensiering til HLCer. Ved vår metode regulerer vi de viktigste signalveiene ved å kontinuerlig supplere Activin A og CHIR99021 under hESC-differensiering til definitiv endoderm (DE), etterfulgt av generering av levergenitorceller, og til slutt HLCer med typisk hepatocyttmorfologi i en trinnvis metode med helt definerte reagenser. HESC-avledede HLCer produsert av denne metoden uttrykker scenespesifikke markører (inkludert albumin, HNF4α nukleærreseptor, og natrium taurocholat kotransporterende polypeptid (NTCP)), og viser spesielle egenskaper knyttet til modne og funksjonelle hepatocytter (inkludert indocyanin grønn farging, glykogenlagring, hematoksylin-eosinfarging og CYP3-aktivitet), og kan gi en plattform for utvikling av HLC-baserte applikasjoner i studiet av leversykdommer.

Det skjematiske diagrammet over HLC-induksjon fra hESCer og representative lysfeltbilder av hvert differensieringsstadium vises i figur 1. I trinn I ble Activin A og CHIR99021 lagt til i 3 dager for å indusere stamceller til å danne endodermceller. I trinn II differensieres endodermcellene i leverforfederceller etter å ha blitt behandlet med differensieringsmedium i 5 dager. I trinn III hadde tidlige hepatocytter modnet og differensiert til HLCer etter 10 dager i HGF og OSM (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for differensiering av humane embryonale stamceller (hESCer) i funksjonelle hepatocyttlignende celler (HLCer) ved kontinuerlig å supplere Activin A og CHIR99021 under hESC-differensiering til definitiv endoderm (DE).

En effektiv metode for rettet hepatocyttlignende celleinduksjon fra humane embryonale stamceller

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Humane embryonale stamcelleavledede hepatocytlignende celler er nyttige i sykdomsmodellering og legemiddelscreening. Dette er en effektiv og reproduserbar metode for effektivt å indusere differensiering av humane embryonale stamceller i funksjonelle hepatocyttlignende celler. En uavklart status og passende sammenløp av humane embryonale stamceller er avgjørende for en vellykket differensiering til hepatocyttlignende celler.For vedlikehold av stamceller, belegge sterile seks-brønns vev kulturbehandlede plater med en milliliter av 1X human embryonal stamcelle-kvalifisert Matrigel per brønn, og lagre dem på fire grader Celsius over natten. La platene stå ved romtemperatur i 30 minutter før bruk. Tine de kryo-bevarte HESE-ene i et 37 grader Celsius vannbad i tre minutter uten risting, og overfør deretter stamcellene umiddelbart ved å pipetter dem inn i et 15 milliliter sentrifugerrør som inneholder fire milliliter forvarmet, 37 grader Celsius mTESR medium.Sentrifuger HESE-ene og aspirer supernatanten, og re-suspender deretter cellene forsiktig i en milliliter mTESR-medium. Aspirer DMEM F-12-mediet fra platen. Frø cellene i en seks-brønns plate med en tetthet på 1 x 10 til femte celler i to milliliter mTESR, og inkuber i en 5% karbondioksid inkubator.Oppretthold cellene ved å erstatte mediet med forvarmet mTESR-medium daglig. Før cellene ved omtrent 70 til 80 % sammenløp, eller når cellekoloniene begynner å komme i kontakt. For celler som passerer, aspirerer du mediet og inkuberer cellene med en milliliter per brønn av enzymoppløsning i fem minutter ved 37 grader Celsius.Overfør cellene ved å pipettere dem til et 15 milliliter sentrifugerør som inneholder fire milliliter DMEM F-12 forvarmet til 37 grader Celsius. Forbered 24-brønns plater ved å belegge dem med 250 mikroliter 1X hESC-kvalifisert Matrigel medium. Frø hESCs med en tetthet på 1 til 1,5 ganger 10 til femte celler per brønn i 500 mikroliter av mTESR medium.Legg både aktivin A til en endelig konsentrasjon på 100 nanogram per milliliter og CHIR99021 til en endelig konsentrasjon på tre mikromolar i et passende volum av forvarmet stadium en differensiering grunnleggende medium. Etter tre dager med differensiering skal differensierte celler uttrykke markører av definitive endodermceller, for eksempel FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 og FOXA1. På dag tre av differensiering aspirerer du mediet, erstatter det med trinn to medium og inkuberer i 24 timer.Endre mediet annenhver dag på dag fire til åtte. Etter åtte dager med differensiering bør differensierte celler uttrykke passende markører av leverforfedrederceller, for eksempel HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. På dag åtte aspirerer du scenen to medium fra cellene, og erstatter den med trinn tre medium.La cellene inkubere i 10 dager ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator, og endre media annenhver dag med nytilsatte differensieringsfaktorer. Etter 18 dager med differensiering skal differensierte celler uttrykke karakteristiske markører av hepatocytter, for eksempel AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Det skjematiske diagrammet med hepatocyttlignende celler fra HESCer og lysfeltbilder av hvert differensieringsstadium vises.I trinn én ble aktivin A og CHIR99021 lagt til i tre dager for å indusere stamceller til å danne endodermceller. I trinn to differensierte endodermcellene seg til leverforfederceller etter å ha blitt behandlet med et differensieringsmedium i fem dager. I trinn tre, etter 10 dager, hadde tidlige hepatocytter modnet og differensiert til hepatocyttlignende celler i hepatocyttvekstfaktor og oncostatin.I den siste fasen av differensiering viste cellene en typisk hepatocytt fenotype. RT-PCR, immunfluorescensfarging og vestlig blotting ble brukt til å oppdage markører av endodermceller, leverforløperceller og modne hepatocytter. De differensierte cellene viste høye uttrykksnivåer av differensieringsrelaterte gener og proteiner i hvert trinn, for eksempel endodermmarkører SOX17 på dag tre, leverforløpermarkør HNF4 alfa på dag åtte, AFP på dag 14 og moden hepatocyttmarkør ALB på dag 18.HLC-ene viste grønn farging og omfattende cytoplasminsyreskiftfarging. Hepatocyttene viste typisk bi-nukleert morfologi. Den enzymatiske aktiviteten til CYP3A4, den essensielle metabolske CYP i leveren i HLCer, ble bekreftet med en enzymanalyse.Å sitte av humane embryonale stamceller med passende tetthet og starte differensiering på følgende dato er kritisk. I trinn én berører du mediet forsiktig fordi cellene er tilbøyelige til å flyte opp. Kombinasjonen av aktivin A og andre små molekyler kan ytterligere forbedre differensieringseffektiviteten, og produsere mer modne hepatocyttlignende celler i denne prosedyren.Denne teknikken kan gi en plattform for å utforske hepatocyttransplantasjon, levervevsteknikk, bioartificial lever og sykdomsmodellering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Avledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Fra Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell av en oligodendrocyte styrt T-Cell angrep i akutt hjerneskiver

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som modell for Infectious Diseases: Culture of Human og Murine Mage Organoids og Mikroinjeksjon av Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolasjon Protokoll for B og T-lymfocytter fra Menneskerettighets Palatine Mandlene

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...